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[摘要] 目的 建立胃肠宁颗粒中布渣叶、功劳木的薄层色谱方法及牡荆苷的高效液相含量测定。方法 采用WondasilTM C18色谱柱，250mm×4.6mm，5μm；流动相为甲醇-0.4%磷酸溶液（30:70）；检测波长为339nm；流速为1.0mL/min；柱温为30℃。结果 牡荆苷在0.0808～0.5050μg的范围呈良好的线性关系，r＝0.9998，平均回收率100.36%，RSD＝3.7%（n=5）。结论 该方法操作简便，重复性好，结果准确可靠，适用于该药的质量控制。
[关键词] HPLC；胃肠宁颗粒；牡荆苷
[中图分类号] R286.0[文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2011）25-79-02
Studies on the Establishment of the Quality Standard of Weichangning Granule
MO JieliZHU Yufang
Guangdong Institute for Drug Control, Guangzhou 510180, China
[Abstract] Objective To identify Microctis Folium, Mahoniae caulis by TLC method and to determine Vitexin in Weichangning Granule by HPLC method. Methods WondasilTM C18column and a mixture of Methanol-0.4% H3PO4 (30:70) as mobile phase were used, and the detective wavelength was set at 339 nm. The flow rate was 1.0 mL/min and the column temperature was 30℃. Results The linear range of Vitexin was from 0.0808 μg to 0.5050μg (r=0.9998). Conclusion The method is simple, accurate and reliable, and can be used in the quality control of the drug Weichangning Granule.
[Key words] HPLC; Weichangning Granule; Vitexin
胃肠宁颗粒由布渣叶、功劳木、辣蓼、番石榴叶、火炭母共五味中药组成，具有清热祛湿、健胃止泻的功效，用于治疗急性胃肠炎、小儿消化不良等症。该品种收载于《中华人民共和国卫生部标准》中药成方制剂第二册，原标准无鉴别、含量测定项目[1]。为进一步加强该品种的质量控制，本文研究布渣叶、功劳木的薄层色谱鉴别以及布渣叶中牡荆苷[2]的含量测定。经对新增项目进行方法学验证，证明试验中建立的方法准确、可行，结果可靠。
1薄层色谱
1.1 仪器与试药
硅胶G（批号：00090427）为青岛海洋化工厂生产，自制板规格10mm×10mm，厚度0.50mm；薄层色谱硅胶预制板为烟台市化学工业研究所生产，规格为10mm×20mm，厚度0.20～0.25mm；Merck硅胶板，规格为10mm×20mm，厚度0.20～0.25mm。其他所用化学试剂均为分析纯。
胃肠宁颗粒（广州汉方现代中药研究开发有限公司，批号：100170、100210、100370）。布渣叶对照药材（中国药品生物制品检定所，批号：121218-200402），功劳木对照药材（中国药品生物制品检定所，批号：121461-200902），盐酸小檗碱对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110713-200911）。
1.2布渣叶的鉴别
取本品8g，研细，加乙酸乙酯50mL，超声处理的时间30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇1mL使溶解，用作供试品溶液。布渣叶对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液。按照薄层色谱法[2]试验，吸取上述两种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（5:3:1:1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同蓝色斑点。薄层色谱图见图1。
1.供试品100170；1.供试品100170；
2.供试品100210；2.供试品100210；
3.供试品100370；3.供试品100370；
4.布渣叶对照药材； 4.功劳木对照药材；
5.缺布渣叶阴性对照5.盐酸小檗碱对照品；
6.缺功劳木阴性对照
图1布渣叶的薄层色谱图 图2功劳木的薄层色谱图
1.3功劳木的鉴别
取本品16g，研细，加浓氨试液10mL、三氯甲烷80mL，加热回流1h，放冷，滤过，滤液加1%氢氧化钠溶液洗涤2次，每次40mL，分取三氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。另取功劳木对照药材1g，同法制成对照药材溶液。再取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1mL各含0.1mg的溶液，制成对照品溶液。按薄层色谱法试验，吸取供试品溶液10μL，对照药材与对照品溶液各1μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-异丙醇-浓氨试液（6:3:1.5:1.5:0.5）为展开剂，放在氨蒸气饱和的展开缸中，展开，取出，晾干，放在紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。薄层色谱图见图2。
2含量测定
2.1仪器与试药
Agilent 1100高效液相仪，VWD检测器；Waters 2695，Waters 2487双波长检测器；TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；Sartorius CP224S电子天平；KQ-300DA型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。牡荆苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号：111687-200501）。胃肠宁颗粒（广州汉方现代中药研究开发有限公司，批号：100110、100160、100170、100210、100270、100370、100470、100570、110110、110310）。甲醇为色谱纯，水为重蒸水，其他为分析纯。
2.2方法与结果
2.2.1色谱条件WondasilTM C18色谱柱，250mm×4.6mm，5μm；流动相为甲醇-0.4%磷酸溶液（30:70）；检测波长为339nm；流速为1.0mL/min；柱温为30℃；进样量10μL。分离度应＞1.5，理论板数按牡荆苷峰计算应不低于3000。色谱图见图3。
对照品样品 阴性
图3胃肠宁颗粒HPLC图谱
2.2.2对照品溶液的制备精密称取牡荆苷对照品适量，加30%甲醇制成每1mL含20μg的溶液，作为对照品溶液。
2.2.3供试品溶液的制备取装量差异项下的本品，研细，取约0.5g，精密称定，加入甲醇25mL，超声处理（功率250W，频率33kHz）30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水5mL使溶解，加于已处理好的Sep-Pak C18小柱（200mg，预处理分别用5mL甲醇、10mL水洗脱，流速1mL/min）上，分别用水、10%甲醇各5mL洗脱，再用30%甲醇约8mL洗脱，收集30%甲醇溶液，置10mL量瓶中，用30%甲醇定容至刻度，即得。
2.2.4 线性关系考察以牡荆苷对照品溶液（浓度为0.0202mg/mL）分别进样4μL、5μL、10μL、15μL、20μL、25μL，按试验方法测定，以进样量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，牡荆苷的回归方程：y=2713.4x＋7.519，r＝0.9998（n=6）。结果表明，绿原酸进样量在0.0808～0.5050μg范围内其进样量与峰面积呈良好的线性关系。
2.2.5精密度试验精密吸取同一牡荆苷对照品溶液10μL，连续进样6次，测定峰面积，计算其RSD为2.0%。
2.2.6稳定性试验取胃肠宁颗粒按测定方法，分别在0、1、3、5、8h测定一次，峰面积的RSD为1.0%。结果表明：供试品溶液在制备8h内测定基本稳定。
2.2.7重复性试验取同一批供试品（批号：100170）5份，分别按测定方法制备供试液并测定，结果样品具有良好的重复性。平均值为0.15mg/g，RSD为1.8%（n=6）。
2.2.8回收率试验取已知含量胃肠宁颗粒（批号100170，0.1502mg/g）的供试品5份，每份取样量为供试品取样量（0.5g）的50%，精密称定。以当前取样含量的1�1，分别精密加入牡荆苷对照品（0.0202mg/mL）2mL，按含量测定方法测定，计算牡荆苷的回收率。结果本方法牡荆苷平均回收率为100.36%，RSD＝3.7%。见表1。
表1回收率试验结果
序号 取样量（g） 样品中牡荆苷的量（mg） 牡荆苷加入量（mg） 总测得量（mg） 回收率（%） 平均回收率（%） RSD（%）
1 0.2513 0.03775 0.0404 0.07730 97.89
2 0.2507 0.03766 0.0404 0.07919 102.78
3 0.2501 0.03757 0.0404 0.07930 103.28 100.36 3.7
4 0.2521 0.03787 0.0404 0.07941 102.81
5 0.2505 0.03763 0.0404 0.0760295.02
2.2.9样品测定取供试品10批，按含量测定方法测定，结果见表2。
表2供试品含量测定结果
批号取样量（g） 峰面积 含量（mg/袋）平均含量（mg/袋）
100110 0.5009 399.5 1.1729 1.1123
0.5006 358.0 1.0517
100160 0.5014 244.8 0.7180 0.7329
0.5007 254.6 0.7478
100170 0.5015 402.1 1.1791 1.1506
0.5017 382.8 1.1221
100210 0.5008 466.3 1.3693 1.3577
0.5017 459.2 1.3460
100270 0.5020 290.3 0.8504 0.8437
0.5008 285.0 0.8369
100370 0.5010 380.4 1.1166 1.0986
0.5000 367.4 1.0806
100470 0.5005 357.3 1.0498 1.1227
0.5010 407.3 1.1956
100570 0.5024 315.7 0.9241 1.0605
0.5025 409.0 1.1970
110110 0.5005 370.8 1.0895 1.0288
0.5011 329.9 0.9682
110310 0.5010 290.5 0.8527 0.8556
0.5028 293.5 0.8585
3讨论
3.1薄层色谱鉴别法的特点
新增的布渣叶、功劳木薄层色谱鉴别经方法学考察，在不同的温湿度及采用不同的薄层板，色谱结果基本重现，说明方法耐用性良好。
3.2含量测定指标的选择
文献报道[3]测定胃肠宁颗粒中的盐酸小檗碱，但其含量偏低，不适于作为定量指标，而且布渣叶为方中的君药，故选取测定布渣叶中的牡荆苷。
3.3含量测定提取方法的选择
本品为颗粒剂，参照《中国药典》一部2010年版布渣叶中牡荆苷的含量测定，分别试验了甲醇、70%甲醇两种提取溶媒，均进行超声提取。根据试验结果，采用甲醇作为提取溶媒，超声30min，样品可全部溶解，方法简单快捷。而采用70%甲醇作为提取溶剂，后续的蒸干消耗时间较多。
3.4含量测定净化方式的选择
由于本品含大量的糖及其他成分相近的黄酮类成分、生物碱等[4-7]，干扰牡荆苷的测定，损坏色谱柱，故需采取适宜的净化方式。经比较液液提取、大孔树脂柱、C18小柱等方法，采用C18小柱方法简单，净化效果较好。比较相同规格的Agilent、Waters的C18小柱，试验结果重现性较好，而菲罗门的C18-E小柱由于填料硅胶经过改性，样品吸附过程已有损失，不适用于本品牡荆苷的测定。
3.5样品的投料及生产
由多批样品的牡荆苷测定结果可见，样品的投料及生产相对稳定。
[参考文献]
[1] 中华人民共和国卫生部.《中华人民共和国卫生部标准》中药成方制剂（第二册）[S]. 北京：人民卫生出版社，1996：166.
[2] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典（一部）[S]. 北京：化学工业出版社，2010.
[3] 袁诚，王华，曾芳芳. HPLC法测定胃肠宁颗粒剂中盐酸小檗碱含量[J]. 中药新药与临床药理，2005，16（5）：361-363.
[4] 曾聪彦，李依信，梅全喜，等. HPLC法测定布渣叶中槲皮素的含量[J]. 今日药学，2010，20（4）：17-19.
[5] 李坤平，潘天玲，高崇凯，等. HPLC法测定布渣叶中牡荆苷和异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖苷的含量[J]. 药物分析杂志，2010，30（9）：1746-1749.
[6] 付辉政，罗永明，张东明. 番石榴叶化学成分研究[J]. 中国中药杂志，2009，34（5）：577-579.
[7] 胡莹，梅全喜. 火炭母的研究进展[J]. 亚太传统医药，2009，5（1）：121-123.
（收稿日期：2011-08-05）
