【www.zhangdahai.com--合同范本】
【摘要】 目的 观察有机磷农药敌百虫对人脐静脉内皮细胞(HUVEC-12)损伤的时相特征，探讨敌百虫诱导内皮细胞损伤的作用机制。方法 将HUVEC-12与含不同浓度敌百虫的DMEM培养基孵24 h后，MTT法检测细胞的活性；以IC50浓度的敌百虫处理细胞一定时间后(0、4、6、8、12、24、48 h)，观察敌百虫诱导内皮细胞损伤的时相特征；硫代巴比妥法检测细胞上清液中丙二醛(MDA)浓度。结果 敌百虫呈时间依赖性地促进内皮细胞凋亡及细胞上清液MDA产生。结论 敌百虫刺激HUVEC-12氧化应激，致细胞损伤。�
【关键词】敌百虫；人脐静脉内皮细胞；丙二醛；内皮型一氧化氮合酶
The damage on human umbilical vein endothelial cell lines induced by trichlorfon
LI Rong-fei， YI Gao-zhong，GUO Peng-cheng， et al.Department of Pharmacology, Huaihua Medical College,Huaihua 418000，China
�
【Abstract】 Objective To explore the time-effect of damage in human umbilical vein endothelial cell lines induced by Trichlorfon and to analyze its mechanism.Methods HUVECs-12 were cultured in DMEM containing Trichlorfon for 24 h， the growth inhibition was measured by MTT assay.Cells were incubated in IC50 concentration Trichlorfon (400 μmol/L) for different times(0，4，6，8，12，24，48 h)) to test the time-effect of damage in human umbilical vein endothelial cells; the level of malondialde-hyde (MDA) in supernatant-conditioned media was monitored by thiobituric acid reaction (TBA).Results Trichlorfon inhibited HUVECs-12 growth in a dose-dependent manner and increased the production of MDA.Conclusion Trichlorfon can induce damage in human umbilical vein endothelial cells.�
【Key words】Trichlorfon;Human umbilical vein endothelial cells;Malondialdehyde;Endothelial nitric oxide synthase
有机磷农药主要通过抑制乙酰胆碱酯酶(AChE)造成乙酰胆碱蓄积，从而激动毒蕈碱和烟碱能受体而产生中枢神经系统症状。然而长期接触较低剂量有机磷农药的人群如农民、从事农药作业的工人等，其AChE活性可能并不降低。我们采用有机磷农药敌百虫（Trichlorfon）与人脐静脉内皮细胞共同孵育建立细胞实验模型，观察较低剂量敌百虫对内皮细胞的损伤作用，探讨敌百虫低剂量敌百虫致血管内皮损伤的时相特征及机制。
1 材料与方法
1．1 材料 人脐静脉内皮细胞株(HUVEC-12)由中南大学湘雅药学院提供，源于美国典型培养物保藏中心（ATCC）。Trichlorfon购于Sigma公司；DMEM购于美国Gibco公司；胎牛血清购于杭州四季青公司；MDA试剂盒购于南京建成生物工程研究所；eNOS一抗购于美国Santa Cruze公司。
1．2 细胞培养 人脐静脉内皮细胞株HUVEC-12，用含10%胎牛血清的DMEM培养基在37℃、5%CO2、饱和湿度的CO2培养箱中传代培养，用0．25%胰蛋白酶进行消化传代。
1．3 MTT法检测细胞活力 取对数生长期细胞，以5×10�7/L的密度接种于96孔平底培养板，随机分为正常对照组（不加干预因素）及7个Trichlorfon药物组，分别以浓度为12．5、25、50、100、200、400、800 μmol/L的Trichlorfon处理各药物组。每孔加MTT 20 μl（5 mg/ml PBS），DMSO 200 μl/孔溶解结晶，酶联免疫检测仪在570 nm波长处测吸光度（OD）值。取各组的均数按公式计算细胞抑制率（IR）：Ir=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%，并求出半数抑制浓度（IC50）。以计算出的IC50值所需Trichlorfon浓度（410 μmol/L），同样方法作用于细胞0、4、6、8、12、24、48 h作时效反应。
1．4 MDA含量测定 收集上述各组细胞培养液按MDA测定试剂盒说明书提供的方法，每管加入样品200 μl，1 cm光径比色杯于532 nm处测OD值。
1．5 统计学方法 所有实验结果以均值±标准差(x±s)表示，处理组间数据用SPSS11．0 统计软件作单因素方差分析和相关性检验，P2+浓度异常升高，触发一系列病理反应，产生大量氧自由基，引起细胞内DNA、RNA、氨基酸、蛋白质以及多糖高分子物质的氧化、交联、变性或降解[1]。其中氧自由基与生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的代谢产物MDA，已成为研究内皮细胞氧化应激损伤的重要指标之一。研究认为内皮细胞MDA含量的升高提示内皮细胞氧自由基水平的增加和脂质过氧化程度的增强，在此基础上抑制内皮细胞DNA合成，阻碍内皮细胞对损伤的自我修复，从而参与动脉粥样硬化的形成[2]。因此测定MDA含量的变化，不仅可以反映出机体体内脂质氧化的程度，又可间接反映出细胞受损伤的程度。本研究结果显示，不同浓度敌百虫与内皮细胞共同孵育24 h后，敌百虫呈浓度依赖性地抑制细胞生长（P
