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韩坤余，熊常州，夏雪，高朗，王怡丁，蔡政，吴继萍，牛华涛
（1.云南中医药大学第一附属医院，云南 昆明 650021；
2.成都中医药大学，四川 成都 610075；
3.云南省中医医院，云南 昆明 650021；
4.云南省肿瘤医院，云南 昆明 650118）
肺癌是最常见的癌症之一，全世界每年有180 多万新确诊的肺癌病例（占全部确诊癌症病例的13%）和160 万肺癌相关死亡病例（占总数的19.4%）［1］。非小细胞肺癌（non－small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌亚型的85%［2］。NSCLC 目前主要采用手术、放射治疗、化疗、靶向治疗和免疫治疗［3］，虽然可缓解患者症状并提高生活质量，但患者的五年生存率仍然很低，且产生很多的毒副作用［4］。中医药具有抑制肿瘤细胞增殖、阻滞癌细胞周期、诱导肿瘤细胞分化和凋亡，下调肿瘤血管内皮细胞生长因子表达，抑制肿瘤血管生成等多种作用［5］。槲皮素（quercetin）是多种中药的有效成分，如半枝莲、败酱草、柴胡、黄芪、黄连和苦参等［6］。现代药理学研究表明，槲皮素具有多重生物活性，如抗氧化、抗病毒、抗癌、肝细胞保护、心脏保护、肾脏保护、神经保护和眼保护等［7］。研究证实，槲皮素可促进癌细胞凋亡、抑制转移、调节细胞周期和抑制肿瘤血管生成［8］，并可通过上调p53、Fas、Bax 和Bag 等凋亡基因以及下调抗凋亡基因Bcl－2，发挥诱导NSCLC 细胞凋亡并抑制肿瘤细胞增殖的作用［9］。网络药理学是一种基于系统生物学理论和大数据挖掘的方法，通过研究中药或中药复方的潜在活性成分和作用靶点，对生物系统的网络进行分析，并系统、全面地评价中药成分与作用机制，进行多靶点药物分子设计的新兴学科［10-12］。本研究运用网络药理学方法，挖掘槲皮素的作用靶点，结合生物信息学的优势，构建“槲皮素－靶点－NSCLC”的网络模型，探究槲皮素治疗NSCLC 的分子与信号通路机制。
1.1 槲皮素作用靶点获取
在Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中获取槲皮素的化学结构式，并通过Pharmmappe（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）和 Uniprot（http：//www.Uniprot.org）数据库获取槲皮素靶标基因。
1.2 NSCLC相关靶点获取
以“non－small cell lung cancer”为关键词在GEO数据库检索并下载NSCLC 基因芯片GSE19188，运用Perl、R 语言进行基因注释以获得NSCLC 相关差异基因。鲁棒多阵列平均（RMA）方法进行芯片数据的背景校正和归一化处理。R 软件limma 包筛选差异表达的基因。以P＜0.05和|logFC|＞1为截断标准。
1.3 网络构建与富集分析
对槲皮素的作用靶点与NSCLC 的相关基因靶点绘制韦恩图，获得槲皮素抗NSCLC 的潜在作用靶点。将其导入STRING 数据库（https：//string－db.org/）。再导入Cytoscape 3.8.0 软件进行可视化分析，构建槲皮素治疗NSCLC 的蛋白质相互作用网络（PPI），使用MCODE 插件进行网络拓扑分析。利用R 语言limma和heatmap 包对槲皮素抗NSCLC 的潜在作用靶点进行结果可视化，得到GO 功能和KEGG 通路富集分析。
1.4 分子对接与生存分析
根据上述筛选的核心靶点，从PDB 数据（https：//www.rcsb.org/）下载蛋白质3D 结构（pdb 格式）。利用AutoDock 软件对靶蛋白进行加水、去氢、分离配体和受体等，并将槲皮素及靶蛋白格式转换为pdbqt 格式。利用AutoDock Vina 计算靶点与配体之间的对接活性，得分＜-7.0 分说明两者之间有强烈的对接活性，可作为槲皮素治疗NSCLC 作用靶点的筛选依据。利用Kaplan－Meier Plotter 数据库（http：//kmplot.com/analysis/）对槲皮素治疗NSCLC 的PPI关键基因进行五年生存与预后分析。
2.1 槲皮素潜在靶点的获取
利用Pubchem 数据库和Pharmmapper 数据库筛选并获得229 个槲皮素化学成分对应靶点蛋白，并通过Uniprot数据库匹配所对应的人类基因靶点。
2.2 槲皮素抗NSCLC的潜在作用靶点
通过基因注释和差异基因筛选共获得1 448 个NSCLC 作用靶点，对229 个槲皮素的有效成分作用靶点与1 448 个NSCLC 作用靶点绘制韦恩图，得到槲皮素抗NSCLC的33个潜在作用靶点。见图1。
图1 槲皮素作用靶点与NSCLC相关靶点交集
2.3 成分－靶点－疾病网络的构建与蛋白质（PPI）分析
将33个潜在作用靶点上传至STRING 数据库得到潜在作用靶点互作关系，导入Cytoscape 3.8.0 软件进行可视化分析，构建槲皮素治疗NSCLC 的PPI网络，见图2。在拓扑网络中包含29个节点，52条边，平均节点度为3.15，平均局部聚类系数为0.575。使用MCODE插件得到3 个功能聚类模块，模块1 共6 个节点和9 条边，得分3.6分，见图3A。模块2共5个节点和5条边，得分5 分，见图3B。模块3 共4 个节点和6 条边，得分4 分，见图3C。根据得分可得到PLK1、KIF11、CHEK1和ANG 等15 个关键基因，其中4 个关键基因的网络拓扑学分析见表1。
表1 槲皮素蛋白相互作用网络拓扑分析（4个核心基因）
图2 槲皮素抗NSCLC靶标蛋白相互作用网络
图3 功能聚类模块
2.4 GO和KEGG富集分析
利用ClusterProfiler 对槲皮素抗NSCLC 的33 个潜在作用靶点进行GO 功能和KEGG 通路富集分析。显著性前15 条的GO 功能与KEGG 通路见图4，图4A、B、C 分别表示前15 条GO 富集分析的生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞组分（CC），图4D 表示前15 条KEGG 通路。生物过程包括先天免疫反应、凋亡过程的负调控和蛋白水解等。分子功能包括蛋白质结合、胶原结合等。细胞组分包括膜、核和细胞质等。KEGG 通路富集分析包括癌症信号通路、TNF信号通路、PPAR 信号通t 路、IL－17 信号通路和细胞色素P450 等。
2.5 分子对接与生存分析
槲皮素与核心治疗靶点PLK1、KIF11、CHEK1、ANG 的分子对接得分见表2，对接图见图5。得分均＜-7.0 分，说明两者之间有强烈的对接活性，可作为槲皮素治疗NSCLC 作用靶点的筛选依据。Kaplan－Meier（K－M）生存分析结果表明，PLK1（P＜1E－16）、KIF11（P= 6.8E－14）、CHEK1（P= 4.11E－15）和ANG（P= 0.004 8）基因与NSCLC 患者的五年总生存率显著相关。见图6。
表2 槲皮素与核心治疗靶点分子对接得分（分）
图5 槲皮素与4个核心基因的分子对接图
图6 生存分析
中医学认为非小细胞肺癌可归于“肺积”“肺壅”“肺岩”“息贲”等范畴。脏腑气血亏虚、邪毒外侵或内生以及气、血、痰、瘀、毒互结为本病主要病机，如《诸病源候论》云：“积聚者，由阴阳不和，脏腑虚弱，受于风邪，搏与腑脏之气所为也”。中医药在治疗非小细胞肺癌方面发挥了独特的优势。研究表明，中药有效成分及复方抗NSCLC的机制包括诱导细胞凋亡、自噬，抑制肿瘤细胞生长、增殖、转移和侵袭等［13］。网络药理学证实多种中药和方剂均具有抗NSCLC的作用靶点，如夏枯草、黄芪和苇茎汤等［14-16］。研究发现，中药联合化疗可显著提高临床疗效和免疫功能，并可降低不良反应发生率。在维持治疗中晚期NSCLC的疾病控制、症状改善、生存期延长及生活质量提高方面，中医药发挥了极大作用［17-18］。
现代药理学研究证实槲皮素及其衍生物可通过抑制有丝分裂所必需蛋白质的合成，使癌细胞周期停滞在G0/G1 期［19］，并激活PI3K/Akt 分子途径，进而减少癌细胞增殖，诱导癌细胞凋亡［20］。研究显示，槲皮素可调节活性氧（reactive oxygen species，ROS）介导的蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）通路，以及调节MAPK 和AMPK 信号通路。PKC 可抑制癌细胞增殖和存活，诱导癌细胞凋亡［21］。AMPK 的重要催化亚基AMPK α1可调控硫氧还原蛋白（thioredoxin，Trx）表达，下调ROS 水平，导致NSCLC 中高表达A549 细胞的凋亡，MAPK 信号通路中的p38 MAPK 途径在影响肿瘤的发生和发展中发挥调控细胞周期、分化、凋亡和自噬等方面的作用［22-23］。槲皮素可激活Caspase－3、Caspase－8 和Caspase－9，刺激促凋亡基因Bax、Bad 的表达，下调抗凋亡蛋白［24］。Caspase－3 的表达可抑制肺癌肿瘤细胞的增殖与迁移［25］。槲皮素可通过抑制EGFR 酪氨酸激酶活性与自磷酸化水平进而影响EGFR 信号通路，超过60%的NSCLC 表达EGFR，EGFR 已成为治疗NSCLC的重要靶标［26-27］。槲皮素还可通过诱导VEGF 受体2（VEGFR2）抑制肿瘤调控因子AKT 的表达，进而影响肿瘤的生长［8］。
Polo样激酶1（polo－like kinase 1，PLK1）参与调节细胞周期进程和不同阶段的有丝分裂。研究表明，抑制PLK1 可导致NSCLC 周期停滞在G2/M 期，抑制有丝分裂纺锤体成熟，而纺锤体的完整性决定了细胞分裂在时间和空间上的准确性［28］。在PLK1 研究最广泛的抑制剂Volasertib 中，人体抑癌基因p53 表达状态不同的NSCLC 细胞系，如A549 和A549－NTC，均可以体现PLK1抑制对细胞生长、周期分布、诱导细胞死亡、细胞衰老和迁移等方面的敏感性［29］。驱动蛋白家族成员11（kinesin family member 11，KIF11）有助于有丝分裂纺锤体的成熟和形成。研究显示，其在NSCLC 中的表达高于癌旁细胞，并且与NSCLC 的总生存时间、总体存活率与不良预后显著相关［30］。检查点激酶（checkpoint kinase，CHEK）的家族成员CHEK1 是miR－195 的直接靶标，miR－195 在NSCLC 中表达的增加抑制了癌细胞的增殖、迁移和侵袭，低CHEK1 蛋白与NSCLC 患者的良好生存有关，作为NSCLC 治疗的新分子靶标，高miR－195、低CHEK1 可以协同抑制肿瘤生长并改善NSCLC 患者的生存［31］。血管生成素（angiopoietin，ANG）家族中的Ang－2 作为一类重要的促血管生成因子，通过IL－10、血管渗漏相关因子和凋亡转移蛋白等可以促进NSCLC 的增殖、侵袭和转移，并且可以与VEGF 通过PI3K/Akt 信号通路途径相互作用，影响肿瘤新生血管的生成［32］。
通过对槲皮素作用的关键靶点进行了GO 生物学过程富集分析，证实了槲皮素对蛋白水解、蛋白质结合和纺锤体微管等生物学过程有一定影响，这些生物学过程在槲皮素治疗NSCLC 所涉及的作用靶点及其相关通路都有体现。在KEGG 富集分析中，证实槲皮素对癌症信号通路、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）信号通路、过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferators－activated receptors，PPAR）信号通路、白介素－17（interleukin－17，IL－17）信号通路和细胞色素P450（cytochrome P450，CYP）等多种癌症相关通路有调控作用。TNF 信号通路的失调可以引起肿瘤，炎症等多种疾病［33］，TNF－α可以激活NFκB 信号通路，起到影响癌细胞增殖、肿瘤血管生成和细胞凋亡等方面的作用［34］。IL－17 在NSCLC 患者肿瘤组织中高表达，并通过趋化作用使炎性因子聚集，炎性因子在肿瘤血管的生成以及免疫调节中具有重要作用［35］，并可通过CD4+、CD8+T 细胞抑制肿瘤细胞浸润，发挥抗肿瘤效应［36］。CYP 可在NSCLC 中高表达，并且可以通过肝脏代谢影响抗NSCLC 肿瘤药物的活性，其中CYP19和CYP24可能成为NSCLC 治疗的新靶点［37］。PPAR的家族成员PPAR－γ可通过拮抗NF－κB通路，抑制NSCLC 肿瘤细胞中血管生成趋化因子的表达，进而影响肿瘤相关血管的生成［38］。
综上所述，本研究运用网络药理学和分子对接分析方法探究槲皮素对NSCLC 的作用机制，为后续实验和临床应用槲皮素辅助治疗NSCLC 提供了新思路和重要理论依据。然而本研究的数据主要从数据库中获得，故具体结果仍需进一步实验验证。
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