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蒋正立 陈 静 夏爱晓 戴丹平
乳腺癌是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤。根据肿瘤的分期和患者身体状况，可采用手术、化疗、内分泌治疗、靶向治疗及中医药辅助治疗等多种手段，而化疗方案中常用药物有蒽环类、紫杉醇类以及长春新碱等。长春新碱（vincristine，VCR）治疗乳腺癌具有较好的临床疗效[1-3]。本文基于网络药理学和生物信息学方法，通过相关数据库筛选VCR 治疗乳腺癌的靶点，分析其生物学功能和作用信号通路，从而探讨VCR 治疗乳腺癌的分子作用机制。
1.1 长春新碱相关靶点预测 VCR 是夹竹桃科植物长春花中提取出的生物碱，以“Vincristine”及其结构为关键词，分别从Drugbank、Swiss Target Prediction、Stitch 数据库预测筛选VCR 相关靶点。
1.2 GEO 基因芯片数据分析乳腺癌相关靶点 从GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）数据库下载编号GSE29044 的基因芯片数据原始文件，采用Geo2r在线工具进行差异基因分析，以|logFC|≥2 和P<0.05为筛选条件进行筛选，绘制前50 个差异基因热图。
1.3 乳腺癌相关靶点获取 以“Breast cancer”为关键词，分别通过CTD（http://ctdbase.org/）和OMIM（http://www.omim.org/）数据库查找乳腺癌相关靶标。并与GEO 基因芯片数据分析得到乳腺癌相关靶点合并删除重复，即为乳腺癌疾病靶点。
1.4 VCR 治疗乳腺癌相关靶点PPI 网络建立及核心靶点获取 将预测得到VCR 靶点与乳腺癌靶点导入Venny 在线工具取交集，即为VCR 治疗乳腺癌相关靶点，导入String 数据库，建立VCR 治疗乳腺癌相关靶点PPI 网络，将结果导入Cytoscape3.7.1 软件，对网络进行拓扑学分析，筛选核心靶点。
1.5 GO 功能和KEGG 通路富集 为进一步阐明VCR 治疗乳腺癌相关机制，将VCR 治疗乳腺癌潜在靶点通过DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）数据库进行GO 功能和KEGG 通路富集分析，并用Prism 软件和在线绘图站Ehbio 将结果绘制成柱状图与气泡图。
1.6 分子对接 采用分子对接方法研究受体蛋白EGFR、TP53、AKT1 与ACR 配体小分子之间的结合模式，以结合能≤-5.0 kJ/mol 为标准，评价VCR 与相关靶点结合作用。
2.1 长春新碱作用靶点 从Drugbank（https://go.drugbank.com/）数据库中得到15个靶点，Swiss Target Prediction 数据库中获得10 个靶点，Stitch 数据库中获得100 个靶点，删去重复靶点，共得到124个VCR 作用靶点。
2.2 乳腺癌相关基因分析与检索 筛选出319 个明显影响和改变的差异表达基因，通过CTD 和OMIM数据库共筛选得到718 个疾病靶点。两者合并，删除重复，共得到1003 个乳腺癌靶点。
2.3 长春新碱治疗乳腺癌靶标分析共得到26 个（映射率为2.4%）VCR 治疗乳腺癌潜在靶标（图2），包括表皮生长因子受体（EGFR）、肿瘤抑制蛋白p53（TP53）、RAC-α 丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶（AKT1）、周期蛋白A2（CCNA2）、90kDa 热休克蛋白αA1（HSP90AA1）、雌激素受体基因（ESR1）、雷帕霉素靶蛋白（MTOR）、B 淋巴细胞瘤-2 基因（BCL2）、非受体酪氨酸激酶（SRC）、多药耐药性蛋白（ABCB1）等。
2.4 VCR 治疗乳腺癌相关靶点PPI 网络建立 通过String 数据库建立PPI 网络，包含26 个节点和133 条相互作用关系（见图2），进一步拓扑学分析，发现其中点度中心性（DC）、接近中心性（CC）和中介中心性（BC）大于均值（点度中心性=10.23，中介中心性=15.85，接近中心性=0.025）的关键节点有10 个，占总节点数的38.5%，其中度值前三为：表皮生长因子受体（EGFR）、肿瘤抑制蛋白p53（TP53）、RAC-α丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶（AKT1），提示它们在整个网络中发挥较为重要的作用。
2.5 GO 功能和KEGG 通路富集 采用DAVID 数据库对VCR 治疗乳腺癌潜在靶点进行GO 富集分析，共得到140 个显著条目（P<0.05），如图3 所示，包括生物过程95 个，主要涉及蛋白质自磷酸化、磷脂酰肌醇介导的信号传导等；
细胞组成11 个，主要涉及质膜、磷脂酰肌醇3-激酶复合物、核等；
分子功能34 个，主要涉及ATP 结合、一氧化氮合酶调节剂活性、激酶活性等。KEGG 富集结果共得到65 条显著通路（P<0.05），排名前20 条通路如图4 所示，主要涉及磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B（PI3K-Akt）、表皮生长因子受体（ErbB）、缺氧诱导因子-1（HIF-1）等信号通路。
2.6 分子对接 采用分子对接的方法研究受体蛋白EGFR、TP53、AKT1 与ACR 配体小分子之间的结合模式。EGFR 与与VCR 配体小分子结合能为-7.66 kJ/mol，TP53 与VCR 配体小分子结合能为-7.89 kJ/mol，AKT1 与与VCR 配体小分子结合能为-5.07 kJ/mol，由此可见VCR 与三个靶蛋白结合能均小于-5 kJ/mol，表明具有较好的结合能力。见表1。
表1 长春新碱与核心靶点分子对接结果
近年来，从基础研究到临床观察多项证据显示，VCR 对于治疗乳腺癌显示了一定效果，不良反应未见升高，可改善患者的生存质量[4-5]，特别是VCR新型给药系统的研究开发，如靶向制剂的研制，可降低VCR 毒副作用，提高治疗效果[6-8]。
本 文 从Drugbank、Swiss Target Prediction 及Stitch 数据库共得到124 个成分靶点，通过GEO 基因芯片数据、CTD 和OMIM 数据库共得到1003 个乳腺癌靶点，因此得到26 个VCR 治疗乳腺癌潜在靶标，建立PPI 网络进行拓扑学分析，获得关键节点10个，分别是EGFR、TP53、AKT1 等。同时，对前三个核心治疗靶点与VCR 进行分子对接，提示VCR 可能通过这些靶点起到治疗乳腺癌的作用。EGFR 靶点对肿瘤生长、发展以及肿瘤干细胞的维持有着非常重要作用，EGFR 表达与乳腺癌患者肿瘤大小、淋巴结转移、病理学分型相关[9-10]，在三阴型乳腺癌中的阳性表达率最高[11]，高表达也提示乳腺癌组织的恶性程度更高、侵袭性更强。TP53 能调节细胞周期和避免细胞癌变发生，VCR 作用于乳腺癌p53 靶点，mRNA 和蛋白水平升高[12]，p53 参与乳腺癌的生物进程与信号通路，使其作为治疗乳腺癌的生物标志物和治疗靶点成为可能[13-14]。AKT1 参与多种生物学过程，在乳腺癌浸润进展过程中发挥重要作用[15]，虽未见文献报道VCR 与此关键基因相关性，基于分子对接结果，很可能参与VCR 的体内作用效应机制。采用DAVID 数据库对VCR 治疗乳腺癌潜在靶标进行GO 功能和KEGG 富集分析，得到140 个显著条目和65 条显著通路，主要涉及PI3K-Akt、ErbB、HIF-1 等信号通路。PI3K-Akt 信号通路涉及细胞增殖、分化、凋亡等多种功能的调节，过度激活的PI3K-Akt 信号通路在乳腺癌的发生、发展中发挥重要作用，为治疗的新兴靶点。多个研究提示，PI3K-Akt 通路为治疗乳腺癌的潜在靶标[16-17]。以上的关键靶点如EGFR、AKT1 等可通过PI3K-Akt 通路，抑制细胞凋亡，VCR 可通过抑制PI3K-Akt 通路，可提高实体肿瘤对VCR 的敏感性[18-19]。ErbB 也是乳腺癌的一个重要分子标志物和治疗靶点，其异常激活可引起细胞生长增殖失控、恶性转化及肿瘤浸润转移[20]，乳腺癌c-ErbB-2 阳性表达率较高，与淋巴结转移和肿瘤标志物水平相关[21]。HIF-1 也参与肿瘤细胞的增殖、对抗凋亡和耐药等重要过程[22]，是VCR 治疗乳腺癌潜在靶点的信号通路，尚需实验验证。
综上所述，本研究筛选了VCR 作用靶点和乳腺癌靶点，得到VCR 治疗乳腺癌的靶点，分析了VCR治疗乳腺癌的生物学功能和作用信号通路，为进一步探讨VCR 抗乳腺癌作用分子机制及靶点提供思路。
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