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方丽，叶琪明，郭方其，周勤，徐丹彬，谢昀烨，武军，王汉荣*
(1.浙江省农业科学院 a植物保护与微生物研究所，b园艺研究所，浙江 杭州 310021；
2.浙江省农业技术推广中心，浙江 杭州 310020)
非洲菊(GerberajamesoniiBolus)为菊科大丁草属多年生草本植物，又称扶郎花、太阳花、灯盏花等，其色泽艳丽，花形优美，花色多样，花期长不易衰败，具有极高的观赏价值和经济价值，是深受大众欢迎的切花、盆栽和庭院观赏植物[1]。非洲菊一次播种后可连续3 a采花，经济效益显著。但受浙江土地少的限制，连作现象普遍，导致菌核病、灰霉病、叶斑病、白粉虱、叶螨等病虫害频发。菌核病作为非洲菊生产上的重要土传病害，导致死苗缺株，长势衰弱，每年造成的产量损失占10%～50%。种植抗性品种是预防非洲菊菌核病最经济有效的途径。然而，目前尚未有关于非洲菊菌核病接种法和抗性评价的相关报道，为了促进非洲菊抗病育种的发展，本文用不同方法对非洲菊品种进行菌核病菌接种，研究适用于非洲菊的抗菌核病的鉴定方法，为非洲菊的抗病育种提供技术支持。
1.1 供试材料
供试非洲菊菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)为浙江省嘉兴地区海宁种植基地的优势菌株，用马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA)从自然发病的非洲菊样品中分离纯化获得，致病力强。
供试的非洲菊品种有亮粉、白马、美满和理想，对菌核病的田间抗性水平由高到低依次为理想、美满、白马、亮粉。于2021年5月15日种植于盆钵中，在温室大棚统一管理。接种时苗龄为180 d左右。接种前后1个月不使用任何杀菌剂，其他栽培管理如常。
1.2 试验方法
用以下4种方法接种非洲菊菌核病菌，非洲菊植株接种后用透明塑料膜保湿培养48 h，每天观察并记录植株发病情况，测量病斑长度，并计算病斑扩展速度。
1.2.1 离体叶片接种
以20～30片叶的非洲菊植株为材料，将叶片分为3类，一类为新叶，为生长点周围2～3片叶；
其次为老叶，该类叶片为植株生长点最外围的叶片，为3～5片叶；
最后是壮叶，为处于新叶和老叶之间的叶片。分别用这3种不同类型的叶片接种菌块，避开叶脉将菌块置于叶肉和叶柄上。每次处理10个叶片作为重复。置于20 ℃光照培养箱，接种72 h后使用十字交叉法测量病斑大小。
1.2.2 牙签接种
市售牙签对半截断后浸泡于液体马铃薯蔗糖(PDA)培养液中48 h，高压灭菌后置于PDA固体培养基上，在皿中央接种菌核病菌，置于25 ℃霉菌培养箱黑暗培养。待菌丝长满培养基以及牙签后，用牙签扎入一个非洲菊中部壮叶叶柄基部(牙签滞留于叶柄内)，每株非洲菊用牙签扎一个叶柄。每个品种接种20株作为重复。
1.2.3 菌块接种
将培养5 d的菌核病菌菌碟接种于新的PDA培养基上，置于25 ℃霉菌培养箱，培养4 d后，用无菌打孔器取直径为5 mm的菌块放置于非洲菊植株的叶柄底部，确保菌块带菌的一面紧贴叶柄表面。每株接种一个菌块，每个品种接种10株苗，重复3次。
1.2.4 菌核接种
将菌核病菌接种于新的PDA培养基上，置于25 ℃霉菌培养箱，培养10 d以上，产生大量菌核后，收集菌核(直径2～3 mm)，将菌核贴着非洲菊植株根基部放置，表面浅覆一层土壤或基质。每株非洲菊植株放置一个菌核，接种20株苗。
1.3 病情分级标准
根据非洲菊菌核病发生及发展规律，参考油菜菌核病[2]和白菜菌核病[3]，我们采用下述植株发病情况与菌丝菌核形成情况相结合的分级标准：0级，全株无病；
1级，部分叶片萎焉，≤5%叶片枯死；
3级，部分叶片萎焉或有病斑，枯死的叶片占总叶片数的5%～10%；
5级，10%～25%叶片萎焉或枯死，或枯死叶片或花葶出现白色菌丝或菌丝团；
7级，25%～50%叶片萎焉或枯死，或枯死叶片或花葶出现白色菌丝或菌丝团；
9级，50%以上的叶片萎焉或枯死，或心叶萎焉，花葶倒伏，叶片或花葶出现菌丝团或菌核。
1.4 病情调查
病情调查一般在接种后20～30 d，也可根据对照品种发病致最高病级时的时间作适当调整。每小区在全部植株均调查，调查并记录发病株数和发病等级。
1.5 抗性评定标准
根据上述病情指数，将其划分为5个类型：免疫(I)，无病；
高抗(HR)，病情指数为0～10；
抗病(R)，病情指数为>10～30；
中抗(MR)，病情指数为>30～50；
感病(S)，病情指数为>50～70；
高感(HS)，病情指数为>70～100。
2.1 叶龄对菌核病菌侵染速度的影响
进行离体叶片接种时，发现不同品种和不同叶龄的叶片，接种菌核病菌后产生病斑的时间以及病斑大小存在差异(图1)。以白马为例，接种菌块后新叶和老叶最先出现浅棕色病斑，而壮叶无病斑。至72 h，新叶和老叶病斑直径分别为3.9 cm和2.2 cm，壮叶病斑直径为1.6 cm。供试的其他品种美满、亮粉与理想出现相同的趋势，即新叶和老叶较壮叶更早发病，且新叶和老叶的病斑直径明显大于壮叶。相同叶龄叶片产生的病斑大小也体现了品种间抗性的差异，理想、美满和白马的病斑明显小于亮粉(图1)。
图1 菌核病菌对不同叶龄的非洲菊品种离体叶片的致病性
2.2 接种部位对菌核病侵染速度的影响
对新叶进行离体叶片接种，同时接种叶肉与叶柄，发现接种叶肉部位的发病速度明显较叶柄发病快。同一叶片中，叶肉与叶柄的发病时间最短间隔为34 h左右。同时菌核病菌的侵染时间与非洲菊品种的抗性有关，侵染时间随着品种的抗性增加而增加(表1)。
表1 菌核病菌对叶片不同部位侵染速度的差异
2.3 带菌牙签接种法对发病情况的影响
带菌牙签接种法接种活体非洲菊后，接种48 h菌丝侵染叶柄，接种处可见白色的菌丝，以放射状向四周扩展，侵染周围的叶柄、嫩叶、花梗等。病斑向四周延伸扩展，发病叶柄处呈水浸状枯斑，叶柄腐软倒伏。其中，理想的扩展速度最慢。接种3 d后非洲菊品种白马的病斑长度平均达5.2 cm，病斑扩展的速度为3.3 cm·d-1，与美满相当，亮粉在6 d时病斑长度已经达到21.7 cm左右，其扩展速度较快，最为感病(表2)。
表2 牙签接种方法测定非洲菊对菌核病的抗性
用带菌牙签接种法显示的品种抗性顺序与田间发病类似。
2.4 菌块接种法
菌块接种活体非洲菊后，由于叶片微环境以及品种抗性的差异，部分接种菌块干枯或未发病，导致发病率下降，抗性品种理想的发病率为70%，而亮粉的发病率高达93.3%(表3)。亮粉接种4 d后可见菌丝块侵染叶柄，随后菌丝向四周扩展，产生褚红色液滴或水浸状病斑。其余品种发病时间为接种后5～6 d。接种10 d后理想的病斑长度达到8.2 cm，扩展速率最小，为2.47 cm·d-1。而白马和美满的病斑长度和扩展速度相当，为3.34和3.28 cm·d-1左右；
亮粉的抗性最弱，扩展速度最快，达到了5.38 cm·d-1。品种间的病斑扩展速度差异与牙签接种法相当，同样体现了不同品种非洲菊的不同抗性水平。
表3 菌块接种法测定非洲菊对菌核病的抗性
2.5 菌核接种法
菌核埋入非洲菊植株的根基部后，菌核的萌发和侵染受环境温湿度、根基土壤理化性质以及品种抗性的影响。发病较牙签和菌块接种法更慢，菌核接种非洲菊品种亮粉后，发病的时间为15 d，而理想、美满、白马等非洲菊品种的发病时间更长。由于菌核具有休眠性，其侵染时间具有不稳定性，较其他两种接种法的发病率更低。接种1个月后，亮粉的发病率为48.5%，其余品种在10%～30%。根部侵染后造成的地上部分的发病情况也较牙签和菌块接种法更不易辨别，例如出现畸形叶，种植长势衰弱，分蘖少，叶片枯死等情况。因此，该接种法不适合作为品种抗性鉴定的评价方法。
2.6 不同接种法的抗性评价
调查了采用带菌牙签和菌块接种法接种后非洲菊的发病情况，与种植于海宁高建伟花卉种植场多年连作地的相同品种的菌核病发生情况比较。结果发现，带菌牙签接种法的发病指数高于菌块接种法，导致理想、白马和亮粉的抗性等级与菌块接种法鉴定结果相比更低，而菌块接种法的评价等级与田间自然发病的评价等级更接近(表4)。
表4 不同接种法的品种抗性评价
菌核病的人工接种法在大白菜[3]、油菜[4-7]、茄子[8]及向日葵[9]等作物上有着一定的研究，包括草酸浸根(叶)法、离体叶片接种法、叶腋接种法、牙签接种法等。其中牙签接种法为油菜菌核病人工接种最常用的方法，用于鉴定和评价不同品种油菜对菌核病的抗性等级，这与本文的研究结果有着较大的差异。本研究比较了叶片的不同部位接种对菌核病发生的影响，及牙签接种法与菌块接种法对非洲菊菌核病抗性表现的差异，发现接种叶肉的侵染和扩展速度明显高于叶柄，而牙签接种制造的伤口有利于病原菌的侵染和扩展，相比于菌块接种法，带菌牙签接种后导致的植物发病率高，病情指数较菌块接种法更高，抗性等级更低。而菌块接种法由于未造成伤口，植物的表面结构抗性也得到了充分的体现，这可能是该方法病情指数低于牙签接种法的原因之一。孙叶烁等[3]用菌块接种法测定了最佳的离体苗龄、部位及温湿度等，发现用菌块接种法接种活体和离体大白菜，均能有效鉴定大白菜的菌核病抗性。杨顺超等[10]在菊花菌核病抗性研究中也发现，菌块接种法可用于区分品种、鉴定抗性水平，这与本研究的结果相同。通过对不同叶龄的叶片菌核病的抗性水平比较，本研究发现，菌核病对衰老和幼嫩非洲菊叶片的侵染和扩展速度明显高于壮叶。由于新叶靠近生长点，易导致植株快速死亡，无法有效地鉴别植株抗性等级，因此，接种老叶比新叶更能体现植株的抗性水平。在条件适宜的情况下叶肉接种更有利于病原菌的侵染，但进行大量试验时也容易发生菌块脱落、失水干涸等情况。而将菌块接种于老叶叶柄则能够减少因温湿度等环境变化导致菌块干涸等情况造成的接种误差，提高测定的成功率。
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