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【摘要】 目的 探讨三磷酸腺苷（ATP）在大鼠胰岛分离过程中抑制胰酶对胰岛细胞的消化作用。方法 将20只SD大鼠平均分为两组，处理组在胰岛分离全过程中加用ATP进行干预，对照组则不加ATP处理，采用Ficoll非连续密度离心纯化后对两组胰岛细胞的凋亡、胰岛产量及活力方面进行比较性研究。结果 加用ATP的处理组的胰岛细胞凋亡率显著低于对照组(P 1.8 葡萄糖刺激胰岛素释放实验检测胰岛功能 纯化后的胰岛经Hanks液洗涤3次，分别转移至无糖，低糖（2.7 mmol/L）和高糖（16.7 mmol/L）无血清RPML-1640培养基中，每孔100个胰岛，于37℃,5%CO2培养箱内培养2 h，收集培养液，用大鼠胰岛素ELISA试剂盒进行检测，测定培养液中的胰岛素水平。
1.9 统计学方法 计量资料均以均数±标准差(x±s)表示。使用SPSS 11.5软件，采用两个样本t检验及两组样本率比较的秩和检验，P0.05)。
2.2 原位末端核苷酸标记法检测胰岛细胞凋亡 胞核呈深棕色的阳性细胞为凋亡细胞。光镜下观察结果显示,处理组的阳性细胞数量明显少于对照组。见图1：
2.3 Annexin V/PI双染色检测胰岛凋亡结果 通过流式细胞仪定量检测胰岛细胞凋亡，结显示ATP处理组的平均细胞凋亡率为(8.6±2.9)%,而对照组为（22.7±3.1）%,处理组的胰岛细胞凋亡率明显低于对照组（P0.05），见表1。
3 讨论
胰岛从生物学特性上看是相当脆弱的细胞团,外界微环境的变化对它形态结构的完整和功能的保持都有着显著的影响。如何提高供体胰岛的数量与质量是近年来研究的一个重要方面。目前的临床胰岛移植，在供体胰岛的分离纯化过程中，存在很多对胰岛损伤的因素，比如机械力的损伤，缺氧，渗透压的改变，纯化介质对胰岛的毒性作用，外分泌部腺泡释放出的胰酶，组织因子［5］等，都会对分离出的胰岛造成损害，或使胰岛团内的细胞死亡，或是激活凋亡程序。有研究用早期凋亡检测法证明，在移植前的胰岛处理过程中，一部分胰岛细胞的凋亡程序已经被启动，事实上胰岛进入受体后的命运，是否能抵抗不良因素而成功存活，在移植前就已经决定。而解决这个问题的重要途径，就是在移植前的整个处理过程中如何对胰岛进行保护［6-7］。
近年相关研究显示，胰岛自供体胰腺血流阻断起即进入缺氧状态，且在整个分离和培养过程中，直至移植后胰岛细胞团内微循环重新建立前的一段时间，都无有效的氧供，缺氧可导致胰岛细胞线粒体受损，ATP生成障碍，细胞正常生理活动受损，离子通道功能障碍，从而无法维持正常膜电位，胞质Ca2+浓度升高，细胞膜损伤和溶酶体损伤，由此引起细胞的死亡或凋亡。
根据以上情况，本实验直接针对缺氧这个重要损伤因素，在整个移植前处理过程中对胰岛进行保护。ATP是维持细胞生命重要的能量物质，细胞微环境内ATP大量缺失将导致细胞死亡。本实验设计的保护因素ATP-MgCl2是临床常用的能量剂和辅酶类药物，可透过细胞膜进入细胞，直接为细胞提供能量,维持细胞正常形态，膜电位，以及维持正常生命活动必需的蛋白质合成功能，且ATP可促进胰岛素的合成，有利于维持和提高待移植胰岛的功能。
实验结果显示ATP处理组的胰岛产量较对照组并无显著差别，但胰岛素释放实验显示实验组的胰岛对葡萄糖刺激的反应能力优于对照组，提示ATP对胰岛的功能具有保护作用。
有研究表明胰岛细胞的凋亡是引起胰岛功能损伤的一个重要因素［10］。为进一步研究ATP对分离胰岛的保护作用机制，本实验特别通过TUNEL以及流式细胞仪对胰岛细胞凋亡的进行检测。结果表明，ATP处理组胰岛细胞的凋亡得到有效控制，细胞凋亡率下降，提示ATP在分离胰岛过程中具有抑制胰岛细胞凋亡的作用，对胰岛功能的损害起到了抑制效果，从而对胰岛的活力具有保护作用。而通过对凋亡相关基因表达的检测，进一步提示了ATP对胰岛凋亡的抑制作用可能是通过促进凋亡抑制基因Bcl-2的表达和抑制凋亡基因Fas-L的表达而实现的。但是对ATP细胞毒性研究显示，ATP同时还具有诱导细胞凋亡的作用［11］，其机制主要与多个嘌呤受体激活有关，包括：P2X1、P2X2、P2X7等。不过近年来的研究显示，虽然ATP对细胞凋亡具有双重作用，但其对产生细胞保护作用的浓度要低于诱导凋亡的浓度很多倍，所以对ATP的浓度控制很重要。另一方面相关研究证明，在胰岛β脉内留置时间长且不易穿破血管壁等优势在临床上得到广泛应用，为了观察BD密闭式静脉留置针在血浆置换术中应用的临床效果，笔者对2005-2008年间，共236例内科系统疾病需行血浆置换的患者， 随机分为BD密闭式静脉留置针组和细胞中ATP对胰岛素的分泌起着重要的调节作用［12］，故选择ATP5000 U/ml浓度，在细胞静息状态下，ATP通过动员胞内钙库的Ca�+释放使胞浆钙离子浓度显著增加，触发β细胞强烈分泌胰岛素。这就能进一步解释ATP处理组胰岛对葡萄糖刺激释放胰岛素量高于对照组的实验结果。
综上所述，本实验提示在胰岛分离过程中使用一定浓度的ATP可以起到保护胰岛，抑制胰岛细胞凋亡，提高胰岛质量的作用。因此有希望成为一种提高临床胰岛移植中供体胰岛分离纯化效果的有效途径。目前需进一步采用大动物实验及更进一步胰岛细胞凋亡观察。
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