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[摘要]目的 探讨rTpN15-17-47-ELISA、RPR和TPPA三种用于梅毒血清抗体检测方法的敏感性和特异性。方法 三种方法分别检测50份无梅毒病史健康人血清、11例类风湿关节炎（RA）、5例肾病综合征（NS）及122例确诊梅毒患者血清标本中梅毒抗体，对各方法的检测结果进行比较。结果 rTpN15-17-47-ELISA对所有健康人血清、RA患者及NS患者血清检测结果均为阴性，对梅毒患者血清标本检测阳性率为97.5%，与TPPA（96.7%）相似（P＞0.05），且均高于RPR（80.3%）。结论 本研究中建立的以重组融合蛋白质rTpN15-17-47为抗原的ELISA有望成为高度敏感和特异的梅毒患者血清学筛查方法。
[关键词]梅毒螺旋体；rTpN15-17-47-ELISA；血清学诊断
[中图分类号] R446.5 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2011）24-133-02
Clinical Evaluation of Different Serological Methods for Diagnosis of Treponema Pallidum
WU Ying1 HU Yujie2 SUN Aihua2
1.Zeguo Branch of Taizhou Combination of Chinese Traditional and Western Medicine Hospital，Zhejiang Province，Taizhou 317500，China；2.Zhejiang Medical College，Hangzhou 310053，China
[Abstract] Objective To evaluate the sensitivity and specificity of rTpN15-17-47-ELISA，RPR and TPPA methods in serological diagnosis of syphilis. Methods The serum samples from 50 healthy individuals，11 RA patients，5 NS patients and 122 syphilis patients were detected by using rTpN15-17-47-ELISA，RPR and TPPA. The detection effect of the ELISA was compared to those of RPR and TPPA. Results The detection results of rTpN15-17-47-ELISA was negative for the serum samples from healthy individuals，RA and NS patients，while presented 97.5% positive detection rates for the serum samples from syphilis patients. The positive detection rates of rTpN15-17-47-ELISA was similar to that of TPPA（96.7%）（P＞0.05），both the positive rates of rTpN15-17-47-ELISA and TPPA were significantly higher than that of RPR（80.3%）. Conclusion rTpN15-17-47-ELISA established in this study is great hopeful to become sensitivity and specificity methods for serological screening and detection of syphilis.
[Key words] Treponema pallidum；rTpN15-17-47-ELISA；Serological diagnosis
梅毒是由梅毒螺旋体（Treponema pallidum）感染引起的主要人类性传播性疾病（STD）之一[1]，因临床表现多样容易造成误诊、漏诊。目前梅毒的实验室诊断主要依赖血清学方法，快速血浆反应环卡片试验（RPR）是目前国内最常用的梅毒临床筛选试验，方法简便、快速，用于梅毒初筛，但特异性不强。明胶凝集试验（TPPA）为代表的特异性的梅毒确诊试验，方法敏感、特异，但需以培养的梅毒螺旋体为特异性抗原，梅毒螺旋体培养困难、成本高，使TPPA难以普及成为梅毒筛选试验[2，3]。本研究利用孙爱华教授建立的以重组蛋白rTpN15-17-47为包被抗原的ELISA并检测122份梅毒血清标本，并对方法的敏感性和特异性进行临床评价。
1 材料与方法
1.1 血清标本来源
梅毒患者血清122份（临床已确诊）由浙江省台州地区多家医院提供，收集上述血清标本医院已进行RPR和TPPA检测。11例RA和5例NS无梅毒病史者血清标本、50例无梅毒病史正常体检者血清标本来自浙江省台州市中西医结合医院。上述标本采集时均获得患者或体检者的知情同意。
1.2 ELISAs建立与应用
紫外分光光度法测定重组蛋白rTpN15-17-47（孙爱华教授前期研究结果）浓度。50μg/mL rTpN15-17-47包被96孔板，37℃温育2h后放置冰箱4℃过夜。次日洗涤3次，用8%BSA封闭。根据预试验结果，50份正常对照血清标本1�800稀释后为一抗。二抗为HRP标记羊抗人IgG（Jackson Immuno Research），显色底物为TMB，测定终止反应后各孔OD450值，计算得正常血清OD450均值和SD值。1�800稀释的梅毒患者、RA及NS无梅毒病史者血清用我们建立的rTpN15-17-47-ELISA检测，若被检标本OD450值≥阴性对照OD450均值＋3SD者为阳性。
1.3 RPR和TPPA检测
按试剂盒说明书对上述梅毒患者血清、RA及NS无梅毒病史者血清标本和健康人血清标本进行检测并进行结果判定。
1.4 统计学处理
采用STATA8.0统计学软件中的χ2检验，对不同检测方法检测阳性率进行比较，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 不同方法检测梅毒患者血清阳性率
检测上述50份健康人血清标本的OD450均值和SD值分别为0.25和0.04，故阳性判断参考值为OD450值≥0.37。根据上述阳性判断参考值，122例梅毒患者血清标本用rTpN15-17-47-ELISA检测阳性率为97.5%（119/122）。RPR和TPPA对上述血清标本检测阳性率分别为80.3%（98/122）、96.7%（118/122）。见表1。
2.2 不同梅毒血清学检测方法比较
rTpN15-17-47-ELISA检测梅毒血清患者的阳性率为97.5%，与TPPA检测阳性率96.7%比较差异无统计学意义（χ2=0.15，P＞0.05），但rTpN15-17-47-ELISA和TPPA检测阳性率均明显著高于RPR阳性率80.3%（χ2=18.37和16.14，P＜0.05）。TPPA是目前临床实验室采用的梅毒确诊试验，RPR和rTpN15-17-47-ELISA检测结果与TPPA比较，符合率分别为83.1%和99.2%，未见TPPA阴性而RPR检测结果阳性情况，但另有2份梅毒患者血清标本TPPA阴性而rTpN15-17-47-ELISA结果阳性。见表2。
3 讨论
梅毒血清学试验有非Tp抗原试验和Tp抗原试验两大类，非Tp抗原试验常见的前者如RPR及甲苯胺红不加热血清试验（TRUST）等，常用于梅毒患者筛查和疗效监测，由于采用心磷脂作抗原、特异性较差，故有RA等少数疾病患者可出现RPR检测假阳性[3]。Tp抗原试验特异性高，但是需制备大量Tp抗原。目前Tp人工培养物主要依赖于Nichols株接种兔睾丸传代和繁殖，产量很低，生产成本高[2]。利用基因工程手段合成重组蛋白具有Tp人工培养物相同的抗原性，不仅缩短获得抗原的时间，且极大降低了生产成本。
TpN15、TpN17、TpN37、TpN44.5和TpN47被认为是最有临床应用前景的梅毒螺旋体外膜蛋白抗原，利用生物工程获得上述外膜蛋白的重组蛋白作包被抗原建立的ELISAs检测血清抗体方法已有不少研究报道，但多为单一外膜蛋白为基础建立的ELISAs，单一重组抗原灵敏度和特异性较低[3，4]。也有少量实验室建立二个或多个外膜蛋白通过多次包被增加方法的敏感性，由于多个抗原需各自表达与提纯不仅增加了制备费用也可能造成更多的误差，不利于方法标准化和推广应用[4-6]。
本研究中，我们梅毒螺旋体主要外膜蛋白TpN15、TpN17和TpN47通过生物工程手段构建的融合抗原TpN15-17-47为包被抗原，建立检测梅毒血清抗体的ELISA检测临床确诊梅毒患者血清标本。由于同时具备三个主要抗原，提高了方法的敏感性，检测结果也表明建立的rTpN15-17-47-ELISA方法检测梅毒血清标本与确诊试验TPPA无显著性差异，显著高于目前临床常用筛选试验RPR，同时建立的融合抗原TpN15-17-47可以保证多个抗原一次表达，能有限降低检测成本。rTpN15-17-47-ELISA有望成为快速、廉价、敏感性和特异性较高的梅毒患者血清学筛查方法。
[参考文献]
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[3] Farhi D，Dupin N. Serological diagnosis of syphilis[J]. Przegl Epidemiol，2009，63（4）：519-523.
[4] 孙爱华，范兴丽，毛亚飞，等. 梅毒螺旋体重组蛋白rTpN17或rTpN47为抗原的ELISA与TRUST和TPHA血清学检测效果的比较[J]. 浙江大学学报医学版，2008，37（1）：67-72.
[5] 杨建兰，郎亦波. 不同血清学诊断方法检测梅毒螺旋体的结果分析[J]. 临床和实验医学杂志，2009，8（5）：90-91.
[6] 沈洪远，余伟，吴敏霞. 三种梅毒血清学试验在梅毒诊断中的应用价值分析[J]. 临床和实验医学杂志，2008， 7（1）：53-54.
（收稿日期：2011-06-27）
