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【摘要】目的探讨真皮下血管网皮瓣血运重建的机制。方法以SD大鼠为实验动物，在背部形成蒂在尾侧的2 cm×7 cm真皮下血管网皮瓣，并将皮瓣人为分成3个区段：1区为近蒂部0～3 cm；2区为距蒂部3～5 cm；3区为皮瓣远端距蒂部5～7 cm。皮瓣直接原位缝合为对照组，分别在1、2区段下方放置硅胶膜为实验组，采用大体肉眼观察、碱性磷酸酶组织化学和免疫组化(CD34)的方法，比较各组皮瓣成活以及不同区段微血管构筑的差异。结果与对照组及1区下方放置硅膜相比，2区下方放置硅膜后皮瓣成活率显著下降；1区下方放置硅膜与对照组之间皮瓣成活率无统计学差异。对照组及在1区下方放置隔膜后皮瓣2区微血管密度较同组1区明显增高。结论真皮下血管网皮瓣中段的缺血缺氧及血运重建对超长比例皮瓣的成活尤其是对皮瓣远端的血运重建具有重要作用。�
【关键词】皮瓣；真皮下血管网；血运重建；酶组织化学；免疫组化
1976年，Myers等［1］提出了真皮下血管网供血成活的随意型皮瓣，国内司徒朴等(1986)［2］首先报告了带蒂移植的真皮下血管网皮瓣的临床应用。该皮瓣具有不臃肿、外观好、长宽比例大、断蒂时间短等特点［2-5］，在临床上也得到了较广泛的应用，但仍存在长宽比的限制及易有花斑、部分血运障碍等并发征。关于真皮下血管网皮瓣的成活机制，目前仍不确定。多数学者认为是随意型皮瓣和真皮下血管网皮片的联合体［4, 6］，即其近端为随意型皮瓣，蒂部血供只能维持一定长宽比例的皮瓣成活，远端的成活依赖受区创基创缘的血供，类同于真皮下血管网皮片的成活。尽管真皮下血管网皮瓣成活长宽比例较传统随意型皮瓣有所突破，但超出范围有一定的限度。而皮片的成活是不受长宽比限制的。这就说明真皮下血管网皮瓣既不是传统随意型皮瓣， 也不是简单的皮瓣＋皮片的联合体，其血运重建有其自身独特的规律。有学者提出真皮下血管网皮瓣成活的“中介蒂”学说［5］，在此基础上，本实验以大鼠为实验对象，通过大体肉眼观察、酶组织化学、免疫组化等方法观察皮瓣基底不同区域对皮瓣成活的影响，并探讨真皮下血管网皮瓣的成活机制。�
1材料与方法�
1．1实验动物体质量250～300 g SD大鼠30只，由南京医科大学动物中心提供，雌雄不限，常规饲养。�
1．2试剂CD34单克隆抗体(CD34(H-140))，购自Santa Cruz biotechnology公司；SABC(StreptAvidin-Biotin Complex)及DAB试剂盒，购自武汉博士德生物工程有限公司；硝基四氮唑蓝/5-溴-4-氮-3-吲哚-磷酸(NBT/BCIP)，购自AMRESCO公司。�
1．3方法�
1．3．1皮瓣模型设计与制备SD大鼠30只，随机分为2组，每组10只。腹腔注射2％戊巴比妥钠50 mg/kg，常规备皮，于背部设计蒂在尾侧的真皮下血管网皮瓣，长×宽＝7 cm×2 cm。并将皮瓣人为分成3个区段：1区为近蒂部0～3 cm；2区为距蒂部3～5 cm；3区为皮瓣远端距蒂部5～7 cm。沿设计线切开皮肤、皮下，由皮下层自远端向近端掀起皮瓣。修除肉膜组织，完好暴露真皮下血管网，彻底止血。各组处理如下：A 组：皮瓣直接原位缝合作为对照组。B 组：在皮瓣1区下方放置硅胶膜片（长×宽＝3 cm×2 cm），固定于皮下，皮瓣原位缝合。C 组：在皮瓣2区下方放置硅胶膜片（长×宽＝�2 cm×2 cm），固定于皮下，皮瓣原位缝合(图1)。各组动物术后均肌内注射青霉素16万单位预防感染。�
图1皮瓣的分区、分组设计及实验组硅胶膜的位置
1．3．2观察指标①大体观察：皮瓣形成后7 d内，连续观察皮瓣的色泽、血运、有无肿胀、水泡、坏死及毛发生长情况。术后第7天，按前述方法麻醉动物，测量各组皮瓣的成活面积，并计算皮瓣成活率（存活面积/皮瓣总面积×100%）。②组织化学染色的观察：术后第7天麻醉动物后，每组动物分别取皮瓣的1区中段（距蒂部1．5 cm）、2区中段（距蒂部4cm）各0．5 cm×1 cm皮肤，方向与皮瓣长轴垂直，分别行碱性磷酸酶组织化学的硝基四氮唑蓝/5-溴-4-氮-3-吲哚-磷酸(NBT/BCIP)染色和CD34的免疫组化法染色，显示皮瓣微血管构筑。酶组织化学法采用OCT包埋低温恒冷切片，厚度50 μｍ，切取组织后速冻，反应体系在有24孔白磁板中进行。流程如下：①切片丙酮固定5 min，吸管吸除；②TSM�1 5 min×2次；③TSM2 5 min×2次；④加显色液，室温下避光显色，1～1．5 h。⑤蒸馏水冲洗终止显色，捞片，晾干后脱水，中性胶封片。免疫组化法采用石蜡切片，厚度5μm。一抗滴度为1∶100，免疫组化的步骤严格按照SABC试剂盒说明书操作。均以PBS代替一抗作阴性对照。Olympus光学显微镜下观察皮瓣微血管构筑情况。�
1．4统计学处理各组皮瓣成活面积及成活率以均数±标准差(x±s)表示，利用SPSS11．0统计程序，采用单因素方差分析及LSD-�t�检验统计结果，以(P0．05，LSD-t test)。�
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表1
A、 B组间比较（P>0．05）差异无统计学意义; A、C组间比较�（P 2．2．1酶组织化学染色血管着染阳性为蓝紫色颗粒沉着，能很好地显示皮瓣不同层次的微血管结构，可见真皮内垂直走向的乳头层血管、水平走向的网状层血管和真皮下水平走向的血管，彼此之间相互交通。A组：和1区相比，2区微血管密度明显增加，毛囊亦增生显著。B组：在1区放置隔膜后，2区血管密度较同组1区明显增加(图2、图3)。C组：在皮瓣2区下方放置隔膜后，血管密度较1区明显减少，毛囊增生不活跃（4、5）。�
图2B组2区×40
图3B组1区×40
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图4C组2区×40
图5C组1区×40��
2．2．2免疫组化染色血管着染阳性为棕黄色颗粒沉着，能较好显示血管内皮细胞。A、B组2区微血管密度较同组1区明显增高。C组在2区放置隔膜后血管密度较同组1区显著降低（6、7）。�
图6C组2区×200
图7C组1区×200
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3讨论�
皮肤和皮下的血管构筑呈多层次的水平网状结构，各层间有垂直的交通支相互沟通。深筋膜以上主要有4层血管网，从上到下分别为：乳头层血管网、真皮血管网、真皮下血管网、皮下血管网。皮肤的动脉血供来源为多源性，随意型皮瓣的动脉主要来自肌皮动脉穿支，也有少数来自直接皮支，它们的分支在真皮下吻合成网。真皮下血管网对局部皮肤的血供起主要作用［7］，是真皮下血管网皮瓣的主要供血系统［1, 8, 9］。皮肤的大部分结构的静脉回流是通过非伴行静脉完成的。乳头层毛细血管袢及真皮内毛细血管均汇入乳头下静脉网，该网在皮肤内形成均匀密集的网格，相邻网格逐步汇合成较粗大的静脉穿过真皮层进入浅筋膜层，直接汇入非伴行静脉［10, 11］。�
目前对于一定长宽比例的随意型真皮下血管网皮瓣通过蒂部和创缘创基供血获得成活的观点比较一致，但对超长型真皮下血管网皮瓣的超长部分的成活机制尚有争议。主要有以下几种学说：①皮瓣＋皮片联合体学说。认为真皮下血管网皮瓣是随意型皮瓣和真皮下血管网皮片的联合体［4, 12］，即其近端为随意型皮瓣，蒂部血供只能维持一定长宽比例的皮瓣成活，远端的成活依赖受区创基创缘的血供，类同于真皮下血管网皮片的成活。因此，加压包扎是保证超长的真皮下血管网皮瓣得以成活的重要条件之一［4］；②蒂部供血说。认为真皮下血管网皮瓣的实质就是传统随意型皮瓣，血供来源于蒂部［3, 13］。其超长部分的成活仍与蒂有关，机理可能是通过微循环平衡调节作用［14］，同时与皮瓣自身代谢及缺氧耐受有关；③“中介蒂”学说。认为在真皮下血管网皮瓣中段存在一血管增生密集区即“中介蒂”，其对皮瓣血运重建具有重要意义，是真皮下血管网皮瓣得以有一定限度的超长成活及早期断蒂的解剖学基础［14, 15］。尽管真皮下血管网皮瓣成活长宽比例较传统随意型皮瓣有所突破，但超出范围有一定的限度，而皮片的成活是不受长宽比限制的。这就说明真皮下血管网皮瓣既非传统随意型皮瓣，也不是简单的皮瓣＋皮片联合体，其血运重建过程有其自身独特的规律。�
在实验中我们观察到，通过阻隔皮瓣中段2区的基底血运，皮瓣的成活率较对照组和阻隔皮瓣蒂部1区均明显降低，提示该区对真皮下血管网皮瓣远端的血运重建和皮瓣的超常规比例成活具有显著的特殊影响。我们的实验进一步证实了宋业光等［5］提出的真皮下血管网皮瓣“中介蒂”的存在。传统随意型皮瓣的成活长度由微血管灌注压决定，因而在特定部位有一定限度，超过限度即会坏死［16］。真皮下血管网皮瓣的成活亦受此约束，这就说明了从一般意义而言，真皮下血管网皮瓣的成活仍然受长宽比限制的原因。Y. Sawada等［17］以大鼠背部随意皮瓣为观察对象，通过腹腔注射染料观察皮瓣染色范围间接反映皮瓣微血管灌注压的有效范围。此范围之外的一定区域，在皮瓣血运重建过程中，既受术后早期缺血、缺氧的刺激，同时仍可获得蒂部来源的血供，通过毛细血管的重新开放、增生扩张、和基底血管的再吻合及新生毛细血管芽的长入缓解了该区及其远端的缺血、缺氧表现［18, 19］，对皮瓣远端的血运重建具有重要意义。我们将这段特定区域称为“临界区”，其在皮瓣中的位置受微血管灌注压的大小影响，并不是指绝对的解剖意义上的皮瓣中段。在实验中我们将皮瓣人为分成不均等的3个区段，保证了“临界区”包含在2区的范围内。实验提示该区对皮瓣的超长规比例成活具有关键作用。�
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注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文”
