【www.zhangdahai.com--其他演讲稿】
[摘要]目的探讨大鼠肾缺血再灌注后不同时间点Smad7的表达，寻找临床预测急性肾功能衰竭的新指标及治疗的新手段。方法建立大鼠肾缺血再灌注模型，当再灌注达相应时间点时，采用全自动生化分析仪、免疫组化、HE染色分别测定或观察血肌酐、尿素氮、肾组织Smad7表达、肾组织病理改变。结果①肾功能改变：与假手术组比较，0h、4h、12h、24h时模型组BUN及Cr均高于假手术组（P＜0.01）。②肾脏组织学改变：模型组的肾组织损伤较假手术组明显加重。③肾组织Smad7的表达：模型组与同一时间点假手术组比较，在0h时肾脏Smad7阳性表达两组表达无差异（P＞0.05）；在4h、12h、24h模型组肾脏Smad7阳性表达较假手术组均减少（P均＜0.01）。 结论 随着肾功能逐渐恶化的同时Smad7表达不断减少。
[关键词] Smad7表达；肾缺血再灌注损伤；血肌酐；血尿素氮
[中图分类号] R692.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2011）20-06-03
Influence of Smad7 Expression in Renal Ischemia-Reperfusion Injury of Rats
XU JunnanWANGRongrongWANG Zhiyi WANG ZhengGONG YuqiangSUN LaifangCHEN Daqing
Department of Emergency Medicine，the Second Affiliated Hospital of Wenzhou University，Wenzhou 325027，China
[Abstract] ObjectiveTo investigate Smad7’s expression in different time in renal ischemia-reperfusion injury（IRI）and search new clinical index and method to forecast acute renal failure. Methods Establishing the model of renal ischemia-reperfusion， When reperfused to the corresponding time point， blood samples were obtained for measurement of serum levels of creatinine（Cr） and blood urea nitrogen（BUN）.Renal tissue was used for histological examination and immuohistochemical analysis of Smad7. Results①Renal function change： Compared with the control group at the time point of 4h，12h，24h after reperfusion， the serum levels of BUN and Cr in the subgroup of the model group were significantly higher（P＜0.01）；②Renal cellular damages in the model group showed more severe than those in the control group； ③Expression of Smad7 in kidney of 0h reperfusion were not different statistically in two groups （P＞0.05）. Expression of Smad7 in kidney of the model group were lower significantly in 4h，12h，24h reperfusion than the control group（P＜0.01）. ConclusionWith the gradual deterioration of renal function，the expression of Smad7 is decreased.
[Keywords] Smad7 expression；Ischemia-reperfusion injury； Creatinine； Blood urea nitrogen
肾缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）是指肾脏缺血组织在重新获得血供后，组织细胞损伤未见减轻反而加重的一种病理现象。TGF-β/Smads蛋白通路是肾脏非常重要的一条信号转导途径，Smad7是TGF-β/Smads蛋白信号通路中最重要的内源性抑制因子，是Smads蛋白家族中的重要一员。前人对此通路作了大量的研究，作为引起急性肾衰肾前性因素的缺血再灌注在此方面研究较少，为了弄清楚肾缺血再灌注时Smad7表达是增加[1]还是减少，因此设计本实验并进行如下报道。
1材料与方法
1.1实验材料
健康雄性SD大鼠80只，月龄6个月，体重220～250g，一级动物，由温州医学院实验动物中心提供。Smad7抗体、SABC免疫组化试剂盒由武汉博士德生物试剂公司提供。DAB显色液由北京中杉金桥试剂公司提供。
1.2实验方法
1.2.1动物分组及方法 雄性SD大鼠80只，随机分为假手术组（A组）和肾缺血再灌注损伤模型组（B组），每组40只，组内按再灌注时间不同又分为再灌注0h、4h、12h、24h 4个小组，每组10只，分别在再灌注到0h、4h、12h、24h时取材。B组建立肾缺血再灌注模型；A组仅作麻醉、开腹，不阻断血流；再灌注达相应时间点时，从各小组大鼠腹主动脉取血2mL备测血尿素氮（BUN）和血肌酐（Cr），然后迅速切除左肾，肾组织用10%甲醛固定，制备石蜡切片，作HE染色观察病理变化以及作免疫组化分析肾组织Smad7表达情况。采用全自动生化分析仪、免疫组化、HE染色分别测定或观察血肌酐、尿素氮、肾组织Smad7表达、肾组织病理改变。
1.2.2肾缺血再灌注动物模型制作及标本采集所有实验动物均术前12h禁食，自由进水。实验大鼠应用10%的水合氯醛按300mg/kg腹腔注射麻醉，仰卧位固定，碘酒酒精消毒手术切口部位，在剑突到耻骨联合之间沿腹白线作一长约6cm的纵切口开腹，找到双侧肾脏，小心分离右侧肾蒂、左侧肾蒂，用无损伤动脉夹夹闭左右侧肾蒂，阻断出入肾脏血流（在此过程中注意保持实验大鼠体温及减少腹腔的不显性失水），见肾颜色由红润变为暗红，表明肾血流阻断，45min后重新恢复肾脏血液灌注。当松开动脉夹后肾脏在2～5min内颜色由暗红转为鲜红表明缺血再灌注损伤模型建立成功，肾血管无血栓形成，关腹。若超过5min肾脏颜色仍然未转为鲜红色则认为肾脏有血栓形成，排除实验组。假手术组游离出双侧肾蒂而不进行夹闭，45min后关腹。实验大鼠麻醉清醒后转入代谢笼内自由进水及进食，再灌注达相应时间点时，从各小组大鼠腹主动脉取血2mL备测血尿素氮（BUN）和血肌酐（Cr），然后迅速切除左肾，置于冰盐水中，洗净表面血液，肾组织用 10%甲醛固定，制备石蜡切片。
1.3指标检测
1.3.1肾功能检测 所取血液标本1500r/min离心30min，用微量加样器吸取上清，置于EP管中，4℃保存于冰箱中。肌酐、尿素氮检测由温州医学院附属第二医院检验科协助完成。
1.3.2HE染色制备肾组织石蜡切片，经HE染色后，光镜下观察肾组织病理改变。
1.3.3免疫组织化学分析石蜡切片经免疫组化处理后，采用Image Plus Pro6.0软件分析免疫组化结果：视野里棕黄色颗粒视为阳性着色，根据着色深浅程度分级：无着色（阴性），浅黄色（弱阳性），棕黄色（阳性），深棕黄色（强阳性）。
1.4统计学方法
采用SPSS12.0 for Windows软件包对实验数据进行统计学处理，数据以均数±标准差（χ±s）表示，采取方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1肾功能变化
与同一时间点假手术组比较，模型组各小组血浆BUN均显著升高（P＜0.01），见表1。同组内不同时间点间BUN的比较：在模型组中各时间点之间比较方差分析有统计学意义（F=49.77，P＜0.01）。其中随再灌注时间的延长，任一时间点均较前时间点BUN明显升高，差异有统计学意义（P均＜0.01）。假手术内各小组无明显差异（F=0.031，P＞0.05）。与同一时间点假手术组比较，模型组各组血浆Cr均高于假手术组（P＜0.01）。见表2。同组内不同时间点间血Cr的比较：模型组中各时间点之间比较方差分析具有统计学意义（F=96.748，P＜0.01）。其中随再灌注时间的延长，任一时间点均较前时间点Cr明显升高，差异有统计学意义（P均＜0.01）。假手术内各小组无明显差异（F=0.018，P＞0.05）。
2.2肾组织形态的改变
假手术组肾小球、肾小管结构完整（封三图1）。肾IR模型组肾脏病理变化明显，多数肾小管上皮细胞肿胀，出现水样变性，部分凝固性坏死、脱落，刷状缘消失，肾小管腔内可见管型，肾间质血管高度扩张充血，可见灶性出血区和灶性炎细胞浸润，但肾小球病变不明显（封三图2~6）。
2.3各组肾组织中Smad7表达情况
在0h时肾脏Smad7阳性表达两组表达无差异（P＞0.05）。见表3。模型组肾脏Smad7阳性表达较假手术组在4h、12h、24h均减少（P均＜0.01）。模型组中各时间点之间比较方差分析具有统计学意义（F=126.150，P＜0.01），其中再灌注0h组Smad7表达的平均光密度较其他各组明显多，差异有统计学意义（P＜0.01）。24h组较4h、12h的平均光密度较大（P＜0.01），4h和12h组平均光密度无统计学差异（P＞0.05）。见封三图7~10。
3讨论
近年来，国内外许多学者研究发现，在各种原因引起的肾功能衰竭中，TGF-β不仅可以抑制小管细胞的增殖并诱导其凋亡，还可诱导小管细胞转分化为肌成纤维细胞（MyoF）[2，3]。与配体结合后，TGF-β家族受体激活了一个由Smad蛋白家族介导的独特的信号转导通路，Smad7是TGF-β/Smads蛋白信号通路中最重要的内源性抑制因子[4]。有学者在研究中发现TGF-β诱导小管细胞生长停滞、凋亡以及小管间质纤维化与其细胞内Smad7负调控作用的不足有关[5]。先前研究表明Smad7的负调控作用存在缺点，Itoh等[6]观察到缺乏配体时，Smad7主要位于细胞核内，有配体存在时，Smad7需完成核到胞质转移过程才能与受体结合，该负调控机制存在反应缓慢，而且也存在蛋白合成不足的问题，因此，有学者采用基因转移技术将外源性的Smad7基因转染到培养的肾小管细胞中，Smad7基因转移后可明显拮抗TGF-β1诱导的G1停滞，提高G2、S的细胞的分布，减低小管细胞的凋亡，可明显拮抗TGF-β1刺激小管细胞分泌FN[7]。
在肾缺血再灌注的研究中发现TGF-β1表达呈增加趋势[8]，在以往的梗阻性肾病研究中发现TGF-β1表达也逐渐增多，Smad7表达减少[9]。Smad7在TGF-β信号传导中是自身调节负反馈机制的重要因子[10]，因此Smad7无论在生理还是病理情况下对细胞内环境的稳定均具有重要作用。本实验研究结果表明在缺血再灌注后模型组肌酐、尿素氮逐渐升高，肾组织形态学变化表明肾组织损伤逐渐加重，Smad7表达逐渐减少，在再灌注24h检测到Smad7表达较再灌注12h有所升高，但肾组织损伤仍进一步加重，从而进一步说明Smad7对TGF-β/Smads蛋白信号通路负调控机制反应缓慢，在无外界因素促Smad7表达增加情况下，难以拮抗肾缺血再灌注对肾脏的进一步损伤。因此在病理状态下，寻找上调Smad7因子表达的方法，减轻缺血再灌注对肾脏的急性期及远期损伤是值得我们继续研究的崭新领域。
[参考文献]
[1] Schiffer M，Bitzer M，Roberts IS，et al. Apoptosis in podocytes induced by TGF-beta and Smad7[J]. J Clin Invest，2001，108（6）：807-816.
[2] Nowak G， Schnellmann RG. Autocrine production and TGF-beta 1-mediated effects on metabolism and viability in renal cells[J]. Am J Physiol，1996，271（3 Pt 2）：F689-697.
[3] Fan JM， Ng YY， Hill PA， et al. Transforming growth factor-beta regulates tubular epithelial-myofibroblast transdifferentiation in vitro[J]. Kidney Int，1999， 56（4）：1455-1467.
[4] Cohen MM Jr. TGF beta/Smad signaling system and its pathologic correlates[J].Am J Med Genet A，2003，116A（1）：1-10.
[5]张金海，黄云剑，蔡文琴. Smad2，3，4，7蛋白在大鼠5/6肾切除肾衰模型中的定位和表达变化[J].第三军医大学学报，2004，26（13）：1141-1144.
[6] Itoh S， Landstrom M， Hermansson A， et al. Transforming growth factor beta1 induces nuclear export of inhibitory Smad7[J]. J Biol Chem，1998，273（44）：29195-29201.
[7]黄云剑，梅煜明，王沂芹，等. Smad7 基因转染拮抗TGF2β1对培养肾小管细胞的影响[J]. 第三军医大学学报，2003， 25（12）：1049-1052.
[8]赵广阔，王心杰，张�. 肾缺血再灌注后内源性转化生长因子β1表达的动态研究[J]. 大连医科大学学报，2009，31（3）：255-269.
[9]王琳娜，宁旺斌，陶立坚，等. 动态观察依那普利对单侧输尿管梗阻大鼠TGF-β1，CTGF，Smad7，α-SMA的影响[J].中南大学学报，2009，34（3）：252-258.
[10] Liu X， Chen Q， Kuang C， et al. A 4.3 kb Smad7 promoter is able to specify gene expression during mouse development[J].Biochim Biophys Acta，2007，1769 （2）：149-152.
（收稿日期：2011-03-28）
注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文
