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[摘要] 目的 探讨缬沙坦与氟伐他汀对阿霉素（ADR）肾病大鼠蛋白尿及肾组织核因子κB（NF-κB）表达的影响。方法 雄性SD大鼠120只，适应性喂养2周后，随机抽取18只为正常对照组(A组)；另外102只制作阿霉素肾病模型。84只造模成功大鼠随机分为4组：B组为模型对照组（等容积生理盐水， n=21），C组为缬沙坦治疗组[缬沙坦3.5mg/（kg・d），n=21]，D组为氟伐他汀治疗组[氟伐他汀10mg/（kg・d），n=21]，E组为缬沙坦与氟伐他汀联合治疗组[缬沙坦3.5mg/（kg・d） 加氟伐他汀10mg/（kg・d），n=21]。其后，分别于2、6、10周末，遵循随机化原则，按n=6分层抽取各组样本，收集24h尿液、血液及肾组织标本待测。结果 与A组相比,B组、C组、D组和E组24h尿蛋白排泄、血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）浓度明显升高（P＜0.01）；免疫组化染色表明， NF-κB阳性积分明显升高（P＜0.01）；缬沙坦与氟伐他汀单用及联用尿蛋白排泄减少，血清TC、TG浓度降低（P＜0.05 或 P＜0.01），肾脏NF-κB表达降低（P＜0.05 或 P＜0.01）。结论 缬沙坦与氟伐他汀可减轻阿霉素肾病大鼠蛋白尿、降低血清TG、TC浓度，降低肾脏NF-κB表达，联用时疗效更明显。提示缬沙坦与氟伐他汀至少部分通过降低NF-κB表达而减轻肾脏损害。
[关键词] 阿霉素肾病；缬沙坦；氟伐他汀；核因子κB
[中图分类号] R587.2[文献标识码] A[文章编号]1673-9701（2011）21-06-03
Effect of Valsartan and Fluvastatin on Reducting the Expression of Proteinuria and Nuclear Factor-κB (NF-κB) in Adriamycin-induced Nephrotic Rats
ZHANG DaoyouWU XiaodongCUI MingchunYANG YanlangYANG LicaiZHU Xinjian.
Departnent of Nephrology, Affiliated Yijishan Hospital,Wannan Medical College,Wuhu 241001,China
[Abstract] Objective To investigate the influence effct of valsartan and fluvastatin on reducting the expression of proteinuria and nuclear factor -κB（NF-κB）in adriamycin-induced nephrotic rats. Methods Male Sprague-Dawley（SD）rats were randomly separated into five groups and given different therapies. Normal control group（group A,n=18）. Nephrotic model was induced by tail introvenously injection of ADR（6.0mg/kg）. Eighty-four ADR-induced nephrotic male SD rats were randomly divided into 4 groups: model control group(group B: normal saline 3mL/d,n=21), valsartan treatment group(group C, valsartan 3.5mg/（kg・d）, n=21）,fluvastatin treatment group(group D, fluvastatin 10mg/（kg・d）, n=21） and combining valsartan with fluvastatin treatment group(group E,valsartan 3.5mg/（kg・d）plus fluvastatin 10mg/（kg・d）, n=21）. After the end of therapies for 2, 6, and 10 weeks, the samples of 24h urine , serum were collected and assayed (six rats were assigned randomly in every group). The renal specimens were taken for the immunohistochemistry of nuclear transcription factor-κB（NF-κB）. Results Compared with group A, 24h urinary protein excretion, the serum levels of total cholesterol, and triglyceride were increased significantly in B, C, D,and E groups（P＜0.01）. Treatment with either valsartan or fluvastatin or combined valsartan with fluvastatin could reduce 24h urinary protein excretion, decrease the serum levels of total cholesterol, triglyceride （P＜0.05 or P＜0.01）, inhibit the expression of NF-κB in renal tissues. Conclusion valsartan and fluvastatin can decrease proteinuria, decrease serum triglyceride, total cholesterol and the expression of NF-κB in renal tissues in ADR-induced nephrotic rats. Combining valsartan with fluvastatin has superiority effects over monotherapies. These results suggest that Valsartan and fluvastatin may mediated through, at least partly, decreasing the expression of NF-κB in renal tissues and attenuating renal damage.
[Key words] Adriamycin-induced nephropathy; Valsartan ; Fluvastatin; Nuclear factor -κB（NF-κB）
肾小球硬化、肾血管硬化和肾间质纤维化是肾功能减退的始动因素，控制或延缓肾纤维化或硬化是治疗的关键。研究表明，核因子κB（NF-κB）过度活化与肾脏纤维化有关。近年有研究表明，噻唑烷二酮对实验性糖尿病肾病的肾损伤的保护作用至少部分是通过抑制NF-κB活化、ICAM-1的表达及巨噬细胞浸润而实现的[1]。为此，我们制备大鼠阿霉素肾病模型，并予以缬沙坦及氟伐他汀干预，探讨阿霉素肾病大鼠NF-κB的变化及药物对蛋白尿及NF-κB表达的影响。
1材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 Sprague-Dawlay 雄性大鼠，体重180～220g，平均（200±20）g，浙江省实验动物中心，合格证号：SCXK（浙）2003-0001，在恒温22℃、相对湿度65％～70％、光照周期12h环境中适应喂养2周后进行试验。
1.1.2 药物与试剂 ① 阿霉素注射剂（浙江海正制药有限公司）；②缬沙坦（北京诺华制药有限公司）；③氟伐他汀钠胶囊（北京诺华制药有限公司）；④NF-κB免疫组化试剂盒(兔抗鼠单抗，P65/Rel-A，SC-8088，北京中杉金桥生物有限公司)；⑤DAB显色剂（武汉博士德公司）。
1.2 方法
1.2.1 建立肾病综合征大鼠模型及分组 120只大鼠适应性喂养2周后随机抽取18只为正常对照组（A组），余102只于尾静脉注射ADR制备NS模型，尾静脉一次性注射ADR 6.0mg/kg，2周末收集24h尿，测24h尿蛋白＞100mg确定为造模成功。正常对照组大鼠尾静脉注射0.5mL生理盐水。2周后造模成功的84只大鼠再随机分为NS模型组（B组，n=21）、缬沙坦治疗组（C组，n=21）、氟伐他汀治疗组（D组，n=21）、缬沙坦与氟伐他汀联合治疗组（E组，n=21），开始干预治疗。A组及B组生理盐水3mL/d；C组以缬沙坦3.5mg/（kg・d）；D组以氟伐他汀10mg/（kg・d）；E组剂量比照单一用药，均予灌胃。
1.2.2 标本收集 分别在干预治疗后第2、6、10周末分阶段每次随机处死6只大鼠，处死前收集24h尿，记录尿量，3000r/min离心15min，去除沉渣后-20℃冰箱中保存。以3%戊巴比妥钠0.15mL/kg麻醉，腹主动脉取血，3000r/min离心15min后，取上清液保存在-20℃冰箱中。取左侧肾脏去包膜后长轴对切，10%甲醛固定，石蜡包埋，以用于免疫组织化学检测。
1.2.3 血、尿生化指标测定 血甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）检测送我院检验科生化室，采用全自动生化分析仪检测（日立 7170）；24h尿蛋白采用双缩脲法检测。
1.2.4 NF-κB免疫组织化学染色 严格按试剂盒说明书操作。阳性结果判定:以胞核、胞浆内棕褐色颗粒为阳性。用免疫组化分析系统(HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告分析系统，同济医学院清屏影像公司)分析：每张切片在高倍镜(×400)下随机选择15个视野的肾小球，用双盲法分别检测每个视野内NF-κB的阳性细胞数，主要观察系膜细胞、上皮细胞、内皮细胞及浸润的炎性细胞。均值表示每组视野中阳性细胞数。
1.2.5 统计学处理 由SPSS13.0统计分析软件完成。所有数据采用均数±标准差（χ±s）表示，组间比较方差齐性者采用单因素方差分析，组内比较采用LSD-t、SNK-q检验。P＜0.05为有统计学意义。
2 结果
2.124h尿蛋白定量及生化指标测定
阿霉素注射后2周，B、C、D、E组24h尿蛋白、TG、TC水平较A组明显升高（P＜0.01）；与B组相比，C、D、E组均降低（P＜0.01）。其中E组较C、D组明显降低（P＜0.01）。而C组24h尿蛋白较D组数值虽有所降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）,见表1。
注：与A组相比具有统计学意义（�P＜0.01） ；与B组相比具有统计学意义（△P＜0.01） ； 与C、D组相比具有统计学意义（★P＜0.01） ；与C组相比无统计学意义（▲P＞ 0.05）
2.2免疫组化肾组织NF-κB表达的变化
A组2、6、10周末NF-κB主要在肾小球及肾小管上皮细胞的胞浆表达，很少在胞核内表达。B组2、6、10周末NF-κB 在细胞核内表达较A组明显（P＜0.01），随着时间的延长，表达愈为增强（P＜0.01）；C、D、E组2、6、10周末NF-κB 在细胞核内表达较A组明显（P＜0.01），但明显低于B组（P＜0.01）。见表2、图1。
注：与A组相比具有统计学意义（�P＜0.01） ；与B组相比具有统计学意义（△P＜0.01） ；与C组、D组相比具有统计学意义（＃P＜0.01） ；与第2周相比具有统计学意义（★P＜0.01）；与C组相比无统计学意义（*P＞0.05）
3 讨论
Bertani等给大鼠注射阿霉素，约2周出现蛋白尿，4周达病变高峰，大鼠出现水肿、大量蛋白尿和高脂血症等肾病综合征表现，其病理改变主要表现为肾小球上皮细胞组突融合、消失和肾小管上皮细胞与肾小球基底膜的局部分离，蛋白尿可持续数月，约半年可诱发肾小球硬化[2]。目前认为。阿霉素肾病模型是经典的动物模型，类似于局灶性节段性肾小球硬化，其特点是肾小球滤过率（GFR）降低，蛋白尿、肾小球硬化、肾小球滤过膜通透性改变，小管间质纤维化等[3]。本实验采用尾静脉一次性注射阿霉素6.0mg/kg，成功制备大鼠阿霉素肾病模型。表现为蛋白尿，脂质代谢异常等。
NF-κB是Rel蛋白家族成员，由于其能与免疫球蛋白κ轻链基因增强子上含10个寡核苷酸区（GGGACTTTCC）位点特异结合，故命名为NF-κB。静息状态下，NF-κB与抑制性蛋白IκB结合以非活性异寡聚体形式滞留在胞浆中，不具转录活性。当细胞受到胞外信号多种因素的刺激时，可引起一系列连锁的酶促反应，最终使NF-κB与IκB解离，NF-κB活化并易位到核内，与其靶基因中启动子或增强子上的κB序列结合，可以诱导或调节许多因子的转录，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、单核细胞趋化因子=1（MCP-1）、细胞间黏附因子-1（ICAM-1）、转化生长因子β1（TGF-β1）等，参与炎症反应、免疫反应、氧化应激和凋亡等一系列病理生理过程的发生和发展[4]。Kumar等研究发现[5]，NF-κB可导致肾组织单核巨噬细胞浸润,从而大量分泌细胞因子、炎症介质及产生氧自由基等,促使细胞外基质（ECM）合成增加。本实验结果亦显示，与正常组相比，模型组与治疗组NF-κB活性明显升高且随着病程延长而加重，而在治疗组中随NF-κB的抑制即伴随着检测指标的好转。因此通过阻断AngⅡ等对NF-κB的激活可能是其肾脏保护作用机制之一。Mezzano等[6]研究发现，用类似于肾病综合征患者尿中发现的浓集白蛋白培养肾小管内皮细胞,可以引起NF-κB活性增加和炎症因子的上调。实验中我们亦观察到NF-κB表达与尿蛋白水平明显相关。
肾素-血管紧张素系统（RAS）在肾脏疾病进展中十分重要,血管紧张素Ⅱ（AngⅡ)主要作用于AT1，影响血液动力学，产生机械损伤[7]；还可通过非血液动力学作用损伤肾脏。在AngⅡ非血液动力学作用中对转化生长因子-β(TGF-β)、NF-κB 的释放最为重要。同时TGF-β又可通过Samd信号转导途径活化[8]，促进炎症细胞浸润和炎症因子（NF-κB等）释放，最终促进细胞增殖、ECM聚集、抑制ECM降解，导致肾脏纤维化[9]。而NF-κB的活化反过来又可通过自分泌方式促进AngⅡ生成，形成恶性循环[10]。缬沙坦为非肽类、口服有效的AngⅡ受体拮抗剂，对Ⅰ型受体（AT1）有高度选择性，可通过血流动力学和非血流动力学作用阻断对NF-κB的活化，从而达到降低蛋白尿、抗炎、减少ECM聚集，减轻肾纤维化之作用。
脂质紊乱也可加速肾脏疾病的进展，脂质和炎症协同无疑加重肾毒性。在NS中高脂血症导致活性氧等氧自由基的大量释放以及脂质的过氧化，活性氧簇（ROS）途径可活化系膜细胞中NF-κB[12]，ROS已被认为是NF-κB激活的重要中介分子，其机制可能是通过PKC-NF-κB依赖途径活化MsC中NF-κB，促使系膜细胞增殖。使用PKC及ROS抑制剂即可有效抑制NF-κB的活化。由此可见,降低NS患者血脂水平,可减少NF-κB的活化,延缓肾病综合征的进展。UsuiH等[13]在研究中证实他汀类药物除了降低血脂作用外,还可通过抑制由NF-κB引起的细胞因子等的表达,改善肾血流动力学的异常及抗氧化等非依赖降脂的肾保护作用而延缓肾脏病变的进展。此外，脂蛋白尤以OX-LDL等在肾脏的沉积可促进系膜细胞增殖、细胞因子的释放及纤维连接蛋白等ECM增多，最终肾小球逐渐趋于硬化[14]。而ARB可以阻断OX-LDL的生成，并增强细胞抗氧化能力。Bernardo等[15]在NS大鼠中采用奥美沙坦和普伐他汀联合治疗可明显降低血脂及尿蛋白，升高血白蛋白，抑制免疫细胞浸润，改善肾功能及减轻肾纤维化。氟伐他汀为羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶抑制剂，可降低胆固醇及甘油三酯浓度。本次实验结果显示，氟伐他汀组较模型组肾脏NF-κB的活性明显降低，从而证实了他汀可抑制NF-κB的活化。而缬沙坦和氟伐他汀联合治疗疗效更为明显，说明多重阻断阿霉素肾病的肾损伤因素可以更好地保护肾脏。
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（收稿日期：2010-08-18）
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