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[摘要] 目的 了解胆囊癌组织中骨桥蛋白和MMP-9的表达及其意义。方法 选择正常的胆囊组织10例、胆囊腺瘤组织10例和胆囊癌组织40例，运用免疫组织化学方法，检测OPN和MMP-9的表达水平，对OPN和MMP-9表达的相关性进行分析研究。结果 胆囊癌组织中OPN和MMP-9的表达水平明显高于胆囊组织和胆囊腺瘤组织（P＜0.05），其中在有转移的胆囊癌组织中OPN的表达水平明显高于没有转移的胆囊癌组织（P＜0.05）。胆囊癌组织中OPN和MMP-9的表达具有一致性（P＜0.05）。结论 OPN与MMP-9的表达情况与胆囊癌浸润、转移发生有密切的关系，本实验结果证实MMP-9和OPN均阳性表达时对胆囊癌转移及预后有重要的预测价值。
[关键词] 胆囊癌；肿瘤转移；骨桥蛋白；MMP-9；免疫组化
[中图分类号] R735.8 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2011）31-61-02
Expression of Osteopontin（OPN）and MMP-9 in Gallbladder Cancer and Its Clinical Significance
XU Guixiang1 WANG Zhenxu1 XU Zhun2 HU Jingjin1 WANG Lin1 TAO Ketao1 HE Songxiong1 ZHANG Guixin1 AN Xin3 XUE Bingchuan3
1.Department of General Surgery，Qingdao Fuwai Cardiovadcular Hospital，Qingdao 266034，China；2.Qingdao Foreign Language College，Qingdao 266000，China；3.Department of General Surgery，the Third Affiliated Hospital of Shanxi Medical University， Taiyuan 030053，China
[Abstract] Objective To explore expression of osteopontin and MMP-9 in gallbladder cancer and its clinical significance. Methods The expression of osteopontin and MMP-9 was detected by immunohistochemical method in 40 cases of gallbladder cancer，10 cases of normal gallbladder and 10 cases of gallbladder adenoma. The relationship between the expression of osteopontin and MMP-9 was analyzed. Results The positive expression rates of osteopontin and MMP-9 in gallbladder cancer tissues were significantly higher than that in normal gallbladder tissues and gallbladder adenoma tissues（P＜0.05）. The positive expression rates of osteopontin in patients of NEVIN Ⅳ，Ⅴstages were higher than that in patients of NEVIN Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ stages）（P＜0.05）. The expression of osteopontin was positively correlated with the expression of MMP-9（P＜0.05）. Conclusion Both osteopontin and MMP-9 are significantly related to the metastasis of gallbladder cancer，and overexpression of both osteopontin and MMP-9 has a predictive value for metastasis and recurrence.
[Key words] Gallbladder cancer；Tumor metastasis；Osteopontin；MMP-9；Immunohistochemistry
笔者采用免疫组织化学方法，检测骨桥蛋白（osteopontin，OPN）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）在胆囊良、恶性病变中的表达，旨在探讨两者在胆囊癌（GBC）的表达情况及其临床意义。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集青岛阜外心血管病医院和山西医科大学第三医院2000年1月～2010年7月的40例胆囊癌标本，均由医院病理科医师从病理学角度予以证实，并且常规按照NEVIN分期方法，将40例胆囊癌标本分档为：Ⅰ期5例、Ⅱ期2例、Ⅲ期10例、Ⅳ期10例，Ⅴ期13例。研究所选的胆囊癌标本均于癌灶中央位置进行常规取材，后用0.5%甲醛固定，常规石蜡包埋。随机选取2000年1月～2010年7月正常的胆囊组织和胆囊腺瘤各10例作为对照组。纳入研究对象的患者术前均未进行抗肿瘤和抗炎治疗。
1.2 方法和试剂
OPN、MMP-9的检测全部采用免疫组化S-P（链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶）法。选用购自美国Chemicon公司的抗OPN兔抗人多克隆抗体，即用型鼠抗人MMP-9单克隆抗体、超敏SP（鼠）免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒购自福州迈新公司。操作步骤：将包埋石蜡的胆囊组织切成厚度为5μm的片→常规脱蜡至水→Tris缓冲液洗3次，每次为5min→3%H2O2浸泡10min→Tris缓冲液缓慢洗3次，每次为5min→在浓度为10mmol/L的枸橼酸（pH6.0）液中煮沸5min共2次→Tris缓冲液洗3次，每次为5min→10%正常羊血清封闭→滴加1抗（即兔抗人OPN蛋白抗体、鼠抗人MMP-9单克隆抗体），恒温箱内37℃放置1h→Tris缓冲液洗共3次每次为5min→用Supervision为二抗，37℃下结合30min→Tris缓冲液洗3次，每次5min→DAB室温下显色10min→流水冲洗5min→苏木精复染→封片。以Tris缓冲液作为一抗定为阴性对照。
1.3 结果判断标准
在光镜下观察，胞质或胞膜有棕黄色染色颗粒为阳性细胞，基质染色除外。所有病理切片均由2位资深病理医师阅片、诊断，显色细胞数＜30%者为阴性（-）；着色细胞数≥30%者为阳性（+）。
1.4 统计学分析
应用SPSS11.5统计软件分析，卡方检验及相关性检验（α=0.05为检验水准）。
2 结果
2.1 各组织中OPN和MMP-9的表达情况
在40例胆囊癌组织中呈阳性表达的分别有33例和29例，10例胆囊腺瘤组织中呈现阳性表达的分别有3例和2例，OPN、MMP-9在10例正常胆囊组织中呈阳性表达的分别有3例和1例。OPN和MMP-9在正常胆囊黏膜组织、胆囊腺瘤组织和胆囊癌组织中阳性表达总体来说均有明显的差异（两者的P值均小于0.01），两者在胆囊癌组织中的阳性表达均明显升高。
2.2 OPN、MMP-9在细胞中表达的定位观察
OPN的表达主要定位于胆囊癌胞质中，少数癌细胞的胞膜亦同时阳性；MMP-9主要定位于细胞浆。见图1、2。
2.3 胆囊癌组织中OPN、MMP-9表达与肿瘤临床及病理学特征之间的关系
OPN、MMP-9的表达在有转移的NEVIN Ⅳ、Ⅴ期患者中和在没有转移的NEVINⅠ、Ⅱ、Ⅲ期患者中的表达有差异（P＜0.05），有转移的患者中OPN的表达明显升高，胆囊癌组织中OPN、MMP-9的表达均与患者的年龄、性别（P＞0.05）无明显相关性。见表2。
2.4 胆囊癌组织中骨桥蛋白和MMP-9表达的相关性分析
胆囊癌组织中OPN和MMP-9表达具有相关性（P＜0.05）。
3 讨论
OPN是一种由多种细胞表达和分泌的磷酸糖蛋白，Senger[1]于1979年研究发现OPN参与细胞黏附、趋化、应激依赖的血管新生、凋亡的阻抑活动。已经有研究证实OPN在胃癌、肝癌等恶性肿瘤组织中均有不同程度的表达。本实验通过对OPN在10例胆囊腺瘤、10例正常胆囊组织和40例胆囊癌切除标本中的表达情况，发现其在肿瘤的侵袭转移中起着重要作用，但在转移早期或中后期的作用孰大孰小尚不确定，国内魏少峰等[2]的实验得出，OPN可能在恶性肿瘤早期侵袭转移过程中起作用。基质金属蛋白酶（MMP）具有锌离子依赖性内肽酶，MMP-9蛋白为其中的代表，表达于肿瘤细胞膜的表面，促进肿瘤细胞的转移的结构和功能调整，被激活后成为Ⅳ型胶原酶，降解并且破坏近肿瘤表面的细胞外基质中Ⅳ、Ⅴ型胶原及明胶，促使肿瘤细胞向周围侵润，最终引致肿瘤的侵袭和转移[3]。Rangaswami等[4]研究亦证实MMP-9活化有赖于OPN的表达增强，而MMP-9的活化加速了肿瘤的扩散。OPN和MMP-9两者关系的研究张东涛等[5]证实OPN与胃癌的侵袭转移有关；陈发龙等[6]证实了OPN和MMP-9在肝癌组织中的表达具有相关性。在40例胆囊癌组织中，27例两者均阳性表达，而这27例中有近19例发生了转移；其中5例两者均阴性表达的病例中，均没有发生转移。OPN和MMP-9比较有显著性差异，本实验研究表明，骨桥蛋白和MMP-9表达可能具有相关的一致性。查阅相关文献结合本实验结果，本人及相关实验人员一致认为，联合检测OPN和MMP-9，在胆囊癌转移的早期发现及判断预后中可能存有重要价值。
[参考文献]
[1] Senger DR，Wirth DF，Hynes RO. Transformed mammalian cells secrete specific proteins and phosphoproteins[J]. Cell，1979，16（4）：885.
[2] 魏少峰，郜玉峰，李旭，等. 骨桥蛋白和P21在原发性肝癌中的表达及其临床意义[J]. 实用肝脏病杂志，2005，8（2）：73-76.
[3] Shirabe K，Shimada M，Kajiyama K，et al. Expression of matrix etalloproteinase-9 in surgically resected intrahepatic cholangiocarcinoma[J]. Surgery，1999，126（5）：842-846.
[4] Rangaswami H，Bulbule A，Kundu GC. Nuclear factor-inducing kinase plays a crucial role in osteopontin-induced MAPK/Ikappa-Balpha kinase-dependent nuclear factor kappaB-mediated pro-matrix metalloproteinase-9 activation[J]. J Biol Chem，2004，279（37）：38921-38935.
[5] 张东涛，袁静，杨力，等. 骨桥蛋白在胃癌中的表达及胃癌侵润转移的关系[J].
中华肿瘤杂志，2005，27（3）：167-169.
[6] 陈发龙，陈军，曾丽霞. 骨桥蛋白与MMP-9在肝细胞癌中的表达及其临床意义[J]. 中国肿瘤临床，2007，34（20）：1160-1163.
（收稿日期：2011-08-16）
