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[摘要] 目的 探讨Bmi-1、P14及P16蛋白在结肠癌组织中的表达情况及其临床意义。方法 选择60份结肠癌组织标本及60份癌旁正常结肠组织，采用组化免疫方法染色，观察Bmi-1、P14及P16蛋白的表达强度、阳性率及其相关关系。结果Bmi-1蛋白在结肠癌组织中表达强度、阳性率高于正常结肠组织，P14及P16蛋白在结肠癌组织中表达强度及阳性率低于正常结肠癌组织。相关性分析发现，结肠癌组织Bmi-1蛋白表达同P14及P16蛋白表达呈负相关关系（r=-0.419，P＜0.05；r=-0.372，P＜0.05），P14同P16蛋白表达呈正相关关系（r=0.537，P＜0.05）。结论Bmi-1蛋白在结肠癌组织过度表达，其可能对P14及P16蛋白的负向调控在结肠癌的发生及发展中发挥作用。
[关键词] 结肠癌；Bmi-1蛋白；P14蛋白；P16蛋白
[中图分类号] R735.3+5[文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2011）27-102-02
Expression and Significance of Bmi-1，P14 and P16 Proteinum in Colon Carcinoma Tissue
CAI Ke1NI Shichang2JIANG Sanya1SHI Bailing1
1.Department of Surgery，the Third Affiliated Hospital of Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine，Zhejiang Province Zhongshan Hospital，Hangzhou 310005，China；2.Department of Anus，Rectum and Colon Surgery，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College，Wenzhou 325000， China
[Abstract] Objective To investigate the clinical significance and expression of Bmi-1，P14 and P16 proteinum in colon carcinoma tissue. Methods Sixty tissues of colon carcinoma and sixty tissues of normal colon were selected and stain with immunizing histological chemistry way. Expression intensity and positive ratio of Bmi-1，P14 and P16 proteinum were detected and correlation between Bmi-1，P14 and P16 proteinum were analysized. Results Expression intensity and positive ratio of Bmi-1 were higher in tissues of colon carcinoma than in tissues of normal colon，expression intensity and positive ratio of P14 and P16 proteinum were lower in tissues of colon carcinoma than in tissues of normal colon， correlation test showed that there were negative correlation between Bmi-1 and P14，P16 proteinum （r=-0.419, P＜0.05；r=-0.372, P＜0.05），there was positive correlation between P14 and P16 proteinum（r=0.537, P＜0.05）. Conclusion Bmi-1 proteinum was over expression in tissues of colon carcinoma，that maybe have a effect in genesis and genesis of colon carcinoma by negative-going control to P14 and P16 proteinum.
[Key words] Colon carcinoma；Bmi-1 proteinum；P14 proteinum；P16 proteinum
结肠癌是临床常见的消化系统肿瘤，结肠癌的发生是多因素长期作用的结果，肿瘤相关的细胞因子及蛋白表达异常与结肠癌的发生及进展密切相关，尤其与细胞周期密切相关的蛋白，在对细胞周期的调控过程中可能引起细胞的异常增殖，导致细胞永生化发生癌变，Bmi-1、P14及P16蛋白是与细胞周期密切相关的蛋白质，本文就其在结肠癌组织的表达及其相互关系进行研究，探讨其在结肠癌的发生发展过程中的作用。
1资料与方法
1.1一般资料
选择我院2006年6月～2010年6月手术切除的结肠癌标本及肿瘤癌旁正常结肠组织各60份，其中结肠癌标本来源患者年龄37～84岁，平均（64.0±7.2）岁，正常结肠组织来源患者年龄35～81岁，平均（63.0±10.4）岁，两组标本来源中患者年龄及性别无显著差异，具有可比性。
1.2试剂及仪器
兔抗人多克隆Bmi-1、P14及P16抗体（南京建成生物工程研究所），SP、DAB超敏显色试剂盒（武汉博士德生物工程研究所）。冰冻切片机（上海精密仪表厂），微波抗原修复仪（常州电子仪器厂），恒温水浴箱（上海精密仪表厂），400目显微镜（北京仪器厂）。
1.3染色方法及观察方法
结肠癌及正常结肠组织标本免疫组化染色方法采用三步SP法[1]，病理标本常规石蜡包埋，4μm厚度连续切片，展片机常规展片、烘干，微波修复抗原，抗杂质抗原采用非免疫山羊血清隔夜孵育后去除，采用PBS缓冲液冲洗后滴加一抗4℃孵育过夜，充分反应后PBS缓冲液冲洗三次，滴加生物素标记的二抗，37℃条件下恒温孵育30min，充分反应后PBS缓冲液冲洗，然后滴加反应终止液终止反应，终止反应后自来水冲洗5min，采用DAB显色，苏木素复染，PBS缓冲液常规返蓝，95%酒精脱水干燥、二甲苯透明、中性树胶封固。
1.4结果判断
染色结果判断采用计数法，采用400目光镜下选择5个不重叠的视野进行细胞计数，依据细胞染色情况。染色程度及染色细胞数量判定结果、浅棕色背景下视野内细胞不着色（－，阴性），棕色背景下视野内细胞淡蓝或者褐色染色为阳性，5个视野内细胞染色计数，如果视野内阳性细胞数累加占全部细胞累加数目小于1/3（++，中等阳性），1/3~1/2分为（+++，中等阳性），大于1/2（++++）为强阳性。
1.5统计学处理
数据分析采用SPSS17.0汉语版统计学软件处理，统计学方法率的比较采用χ2检验，相关性采用Spearman相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1Bmi-1、P14及P16蛋白在结肠癌组织的表达（表1）
结肠癌组织及正常结肠组织Bmi-1蛋白主要在细胞核及细胞浆表达，P14蛋白主要在细胞膜及细胞质表达、P16蛋白主要在细胞核表达、阳性表达者呈现棕黄色或黄褐色颗粒样染色，Bmi-1、P14及P16蛋白在结肠癌组织表达阳性率分别为90.0%、23.3%及28.3%，在正常结肠组织表达阳性率分别为31.7%、76.7%及70.0%，结肠癌组织Bmi-1蛋白表达阳性率高于正常结肠组织，P14及P16表达阳性率低于正常结肠组织。
表1Bmi-1、P14及P16蛋白在结肠癌及正常结肠组织中的表达
[n（%）]
组织 n Bmi-1 P14 P16
结肠癌组织 60 54（90.0） 14（23.3） 17（28.3）
正常结肠组织 60 19（31.7） 46（76.7） 42（70.0）
χ2 8.26 6.91 5.42
P 0.004 0.005 0.008
2.2 结肠癌组织Bmi-1蛋白与P14和P16蛋白表达相关关系（表2）
在结肠癌组织中，Bmi-1与P14蛋白同时阳性表达例数为12例，约为20.0%，同时阴性表达例数为4例，比例约为6.7%；在结肠癌组织，Bmi-1与P14蛋白表达呈现负相关关系（r=-0.419，P=0.002），在结肠癌组织，Bmi-1与P16蛋白同时阳性表达者14例，比例约为23.3%，同时阴性表达者3例，比例约为5.0%，在结肠癌组织，Bmi-1与P14蛋白表达呈现负相关关系（r=-0.372， P=0.021）。
表2结肠癌组织 Bmi-1蛋白与P14和P16蛋白表达相关性分析
Bmi-1 P14 合计 P16 合计
＋ － ＋ －
＋ 12 42 54 14 40 54
－ 2 4 6 3 3 6
合计 14 46 60 17 43 60
2.3结肠癌组织P14与 P16表达的相关关系（表3）
在结肠癌组织，P14及P16蛋白同时阳性表达者为13例，比例约为21.7%，同时阴性表达者比例42例，比例约为70.0%，在结肠癌组织，P14同P16蛋白表达呈现正相关关系。
表3结肠癌组织P14与 P16表达的相关性分析
P14 P16 合计
＋ －
＋ 13 1 14
－ 4 42 46
合计 1743 60
3讨论
结肠癌是常见的消化系统肿瘤，发病率较高，结肠癌的发生过程是抑癌因子与促癌因子失衡的过程，大部分与恶性肿瘤相关的细胞因子都与细胞周期密切相关，或者作用于细胞分裂周期关键的酶，引起细胞周期的异常，最终导致细胞增殖及凋亡机制的失衡，导致组织细胞恶变。Bmi-1、P14及P16蛋白均是与细胞周期密切相关的蛋白质，Bmi-1蛋白是Ploycomb组蛋白（Ploycomb-group，PcG）家族成员之一，PcG组蛋白在机体发育过程中发挥对控制基因活性的调节作用，在机体发生及发育过程中，其调节多种基因表达，PcG家族基因过度表达或发生突变时，都会引起机体发育异常或畸形，甚至诱发肿瘤的形成。Bmi-1蛋白参与原始干细胞的分化、细胞周期调控以及衰老等生命过程[2]。在细胞的增殖、分化过程中起着主要作用，其与肿瘤的发生发展密切相关，Bmi-1蛋白可上调hTERT的转录，使端粒不能够随细胞的分化、增殖逐渐缩短，引起细胞的增殖活性增高，凋亡机制减弱，甚至引起细胞永生化，在细胞恶性转化中起重要作用[3]，Bmi-1蛋白的过度表达可能是细胞恶变的始动机制之一。P14及P16蛋白是抑癌基因INK4a/ARF编码的蛋白质，P16蛋白为细胞周期依赖性激酶抑制剂， P16蛋白主要作用于细胞G1期向S期的演进过程，能够通过对CyclinD与CDK4/CDK6结合活性的调节，激活CDK4/CDK6，继而促进转录因子合成，使细胞由G1期进入S期[4]，在此调节链中p16INK4a蛋白起着负反馈的作用，对细胞增殖周期起负性调节作用。一旦p16INK4a基因发生变异，将导致肿瘤的发生，P16的表达缺失甚至能够作为肿瘤的早期事件对肿瘤的发生进行预测。P14为可变读框基因（alter-ative reading frame，ARF），由外显子1β、2和3编码，由132个氨基酸组成，分子量为1390Da的蛋白质。p14ARF蛋白能稳定和提高细胞p53水平[5]，增强p53在G1/S期和G2/M期的限制点效应，最终使细胞阻滞于G1期和G2期，具有细胞周期负调控作用。
研究表明[6]，P14蛋白缺失的小鼠能够形成肿瘤，表明 P14蛋白在肿瘤发生中可能起一定作用。在结肠癌组织的研究中发现，Bmi-1蛋白在结肠癌组织过度表达，而P14和P16蛋白存在明显的表达缺失现象，说明Bmi-1、P14及P16蛋白共同参与直肠癌的发生过程。对结肠癌组织Bmi-1、P14及P16蛋白表达的进一步研究发现，在结肠癌组织Bmi-1表达同P14及P16蛋白表达呈现负相关关系，说明其可能通过对P14及P16蛋白表达的负性调控，进而使细胞凋亡机制失常，引起细胞的异常增殖。既往的研究也证实，Bmi-1基因转导可抑制细胞的P16的表达，延长细胞的生存周期[7]。但在正常老化细胞中，Bmi-1并不下调P16蛋白表达，表明可能存在其与细胞增殖有关的Bmi-1靶点，在细胞凋亡抑制时靶点激活。研究结果也显示，结肠癌的发生并非单一细胞因子或促癌因素引起的，而是多因素共同作用的结果，Bmi-1、P14及P16均参与结肠癌的发病过程并存在相互的调控关系。
[参考文献]
[1] 黄秀娟，张喜，邓昊. 免疫组化PV二步法与SP三步法比较[J]. 数理医药学杂志，2009，22（1）：27-28.
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[6] Kamijo T，Bodner S，van de Kamp E，et al. Tumor spectrum in ARE-deficient mice[J]. Cancer Res，1999，59（9）：2217.
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（收稿日期：2011-07-07）
