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[摘要] 目的 本研究旨在探讨丹曲林对四氧嘧啶诱导的糖尿病家兔心房肌结构重构及体内氧化应激水平的影响。方法 应用四氧嘧啶成功诱导糖尿病家兔24只，随机分为糖尿病组和丹曲林干预组，12只正常家兔为对照组，分别测定氧化应激指标一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）及胶原容积分数。 结果 与正常对照组相比，糖尿病组兔的MDA水平明显升高，SOD 水平有降低趋势，丹曲林干预组SOD高于糖尿病组，而MDA水平明显低于糖尿病组，两组间有统计学差异（P＜0.05），HE及MASSON染色示糖尿病家兔左房肌细胞较正常组排列紊乱，炎症浸润，纤维化明显，而丹曲林干预组炎性改变及纤维化程度均减轻，两组比较有统计学差异（P＜0.05）。结论 丹曲林干预组体内氧化应激水平及心房肌纤维化程度均较糖尿病组家兔减轻，提示丹曲林能够拮抗糖尿病家兔氧化应激反应及心房肌纤维化。
[关键词] 糖尿病；丹曲林；心房结构重构；氧化应激
[中图分类号] R965 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2011）35-07-02
The Effect of Dantrolene on the Atrial Structural Remodeling and Oxidative Stress in Alloxan-induced Rabbits
LU Jianhong ZHAI Changlin CHEN Jie
Department of Cardioligy，the First People"s Hospital of Tongxiang in Zhejiang Province，Tongxiang 314500 China
[Abstract] Objective To investigate the influence of dantrolene on the level of GSH，SOD，NO，MDA and collagen in left atrium in alloxan-induced rabbit model. Methods Twenty-four alloxan induced diabetic rabbits were divided into two groups（n=12）： Diabetic group（D） and group diabetic rabbits receiving Dantrolene（DR）. 12 normal rabbits were assigned as control group. All animals were measured level of SOD， MDA， NO and GSH and left atrial collagen volume fraction. Results SOD level decreased and MDA level increased in diabetic rabbits group compared with control group（P＜0.05），while in dantrolene group the parameters didn’t have significant difference compared with control group，but they had significant difference compared with diabetes group（P＜0.05）.Masson stained of left atriai tissure showed that LACVF in diabetic rabbits was more higher than normal but in dantrolene group it was decreased（P＜0.05）. Conclusion The study shows that dantrolene may reduces oxidative stress in the diabetic rabbits and inhibits fibrosis process in Left atrium of the diabetic rabbits，and dantrolene may be have potential effect on preventing atrial flatter process.
[Key words] Diabetes；Dantrolene；Fibrosis；Oxiditave stress
心房颤动（AF）为临床常见的心律失常之一，易导致中风、心律衰竭、慢性疲劳综合征等，心房重构是房颤发生和维持的重要机制，糖尿病是AF发生的独立危险因素[1]。目前的研究表明房颤时心房肌细胞内钙超载对心房发生结构重构及电生理重构起重要作用。丹曲林（dantrolene）在临床上主要适用于治疗恶性高热病，是细胞内质网上钙通道受体的拮抗剂，可降低细胞质内过高的游离钙离子浓度，减轻钙超载。有研究表明，丹曲林可通过改变大鼠心肌糖代谢酶活性，保护大鼠缺血再灌注心脏的功能[2]。目前，国内外尚无评价丹曲林干预糖尿病兔心房结构重构的报道。本研究旨在建立四氧嘧啶诱导的兔糖尿病模型评价丹曲林对糖尿病兔心房结构重构的干预作用及评价其对家兔机体氧化应激水平的影响。
1 材料与方法
1.1 动物选择及分组
成年健康家兔36只，体重1.5～2.0kg，雌雄不限，浙江大学医学院动物室提供，采用随机数字表法，将其随机分为三组： 对照组（C组）、糖尿病组（D组）及丹曲林干预组（DR组），每组12只。
1.2 造模和丹曲林处理
D及DR组共计24只以四氧嘧啶120mg/kg经耳静脉注射造模。经测定注射48h及1周后检测空腹血糖，两次空腹血糖≥11.0mmol/L认为造模成功。实验家兔在清洁条件下喂养饲料80g/d。其中丹曲林干预组每只家兔予丹曲林2mg/48h静脉注射，共4周，每周固定时间测定体重及空腹血糖，4周后抽取耳静脉血行血清胰岛素及氧化应激指标测定并处死剪取左房标本行组织学检查及测定左房胶原容积分数（LACVF）。
1.3 试剂
超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、一氧化氮（NO）试剂盒、谷胱甘肽（GSH）测定试剂盒、丙二醛测定试剂盒（MDA）、血清胰岛素测定试剂盒均购自上海凯云科技有限公司，制造糖尿病家兔模型用四氧嘧啶购自上海华蓝化学技术有限公司，试验用注射丹曲林为辉瑞公司生产，快速测定血糖仪及试纸为瑞典Medi-smart公司生产。
1.4 取材和标本制备
所有家兔喂养4周后，处死取左房标本固定于10%中性福尔马林液中，24h后行石蜡包埋、切片（4～5cm），分别行苏木素-伊红染色（HE）及MASSON染色并测定左房胶原容积分数。
1.5 组织学检查
所有家兔心房肌标本行HE染色，光镜下观察心房肌一般组织特别是心肌横截面，全部心房肌标本行MASSON染色并测定左房胶原容积分数。
1.6 氧化应激指标测定
所有家兔取耳缘静脉血3mL， 以4000转超速离心后取血清于-80℃冰箱保存。统一检测血清氧化应激指标和血清胰岛素水平。
1.7 统计学处理
计量资料采用（χ±s）表示，并进行正态性及方差齐性检验，多组均数比较采用ANOVA分析，两两比较采用Dunnett-t检验；计数资料采用χ2检验， P＜0.05为差异有统计学意义，上述统计学处理采用SPSS11.5统计软件完成。
2 结果
2.1 糖尿病家兔血清氧化应激指标的变化
由表1可知，各组数据均符合正态性及方差齐性检验，D组家兔SOD水平明显低于C组（F=2.52，P＞0.05，总体方差相等；ν=33，Dunnett-t=3.17，P＜0.05），而MDA水平明显高于C组（F=1.92，P＞0.05，总体方差相等；Dunnett-t=4.26，P＜0.05），DR组SOD及MDA水平与对照组无明显差别（F=2.12，Dunnett-t=2.03；F=2.55，Dunnett-t=1.96，P＞0.05），D组家兔的血清SOD水平明显低于DR组，而MDA水平明显高于DR组（F=2.62，Dunnett-t=3.28；F=2.03，Dunnett-t=2.86，P＜0.05），但是GSH和NO水平三组间均无统计学差异（F=2.51，1.98，P＞0.05）。
2.2 糖尿病家兔左房心肌组织学结构及纤维化指标的变化
与正常对照组相比，D组兔左房心肌组织HE染色显示心肌细胞排列方向呈无规则变化，并伴有大量炎症细胞的浸润，而DR组心肌细胞排列紊乱明显减轻（封三图1）。D组家兔左房心肌组织MASSON染色显示左心房肌间质显著纤维化表现，胶原容积分数显著增加（P＜0.01）（封三图2），而DR组左房心肌间质纤维化程度明显减轻，测得胶原容积分数明显低于糖尿病组（封三图2），两组比较有统计学差异（P＜0.05），见表1。
3 讨论
本研究采用兔作为糖尿病动物模型，在给药干预、取血、抗病性等方面明显优于大鼠。经典的四氧嘧啶诱导法[3]相比其他药物具有建模成功率高、作用温和、对其他组织的毒性相对较小的优点。血清学检测指标与病理检测结果发现，与正常家兔比较，糖尿病家兔血清的氧化应激指标水平明显增高，左房心肌重构明显，纤维化加重，而丹曲林则可降低糖尿病家兔的氧化应激水平和心房肌纤维化程度，而丹曲林对糖尿病兔的空腹血糖及胰岛素水平未见明显的影响。
房颤是临床上最常见的心律失常，而糖尿病是房颤发生的危险因素之一。近年来的研究显示炎症介导的氧化应激在AF的发生发展中占据着重要的地位[4，5]，临床研究也表明他汀类药物、血管紧张素转换酶抑制剂（ACEIs）及血管紧张素受体拮抗剂（ARBs）、糖皮质激素、多不饱和脂肪酸及维生素C等具有潜在抗炎及抗氧化作用的药物对于AF有一定的预防和治疗作用[6，7]。糖尿病引起的AF机制目前尚不明确，Kato等[8]的研究表明糖尿病能够导致心房结构性重构、延长房间传导时间以及增加AF的发生率。
结构重构是房颤自我稳定的机制之一，动物实验发现心房纤维化造成可诱发房颤的持续[9]。各种因素引起的心房肌细胞内钙超载对心房发生结构重构及电生理重构起重要作用。目前关于丹曲林对AF预防作用的临床研究尚少，Yu G等[10]研究发现丹曲林可保护大鼠缺血再灌注心脏的功能，王丽艳[2]等研究发现丹曲林能够影响缺血再灌注大鼠心肌糖代谢酶活性，增加冠脉流量，对缺血再灌注的心肌有保护作用。
本实验中，D组家兔和DR组家兔的血糖水平未降低，可能是经四氧嘧啶诱导的糖尿病家兔胰岛素分泌功能不足引起，因其增加了胰岛素敏感性，从而使两组胰岛素水平都有下降。MDA、GSH、SOD以及NO反映氧化应激的水平，本实验中测得与C相比，D组兔的MDA水平明显升高，SOD水平有降低趋势，DR组SOD高于D组，而MDA水平明显低于D组，而GSH 和 NO水平三组无差异，本试验丹曲林对NO和GSH未产生影响可能与观察时间不足有关。HE及MASSON染色示糖尿病家兔左房肌细胞较正常组排列紊乱，炎症浸润，纤维化明显，而DR组炎性改变及纤维化程度均减轻，两组比较有统计学差异。
综上所述，我们的实验结果表明与糖尿病家兔组相比，丹曲林能够减轻家兔左房结构重构变化，推测其在AF的发生发展中可能起到了一定的保护作用，那么该类药物是否能够逆转糖尿病兔心房的电重构以及具体的分子机制，还需进一步深入研究。
[参考文献]
[1] Lip GY，Varughese GI. Diabetes mellitus and atrial fibrillation：perspectives on epidemiological and pathophysiological links[J]. Int J Cardiol，2005，105（4）：319-321.
[2] 王丽艳，赵晓丽，郭彦青，等，丹曲林对缺血再灌注大鼠心肌糖代谢酶活性的影响[J]. 天津医药，2011，39（7）：631-633.
[3] 冯丹，张新国. 糖尿病的动物模型[J]. 武警医学，2007，（5）：23-25.
[4] Liu T，Li G. Is atrial fibrillation an inflammatory disease[J]. Med Hypotheses， 2005，64：1237-1238.
[5] Korantzopoulos P，Kolettis TM，Galaris D，et al. The role of oxidative stress in the pathogenesis and perpetuation of atrial fibrillation[J]. Int J Cardiol，2007，115：135-143.
[6] Liu T，Li GP，Huang TG. Anti-inflammatory therapies in atrial fibrillation[J]. Int J Cardiol，2005，104：359-360.
[7] Musco S，Conway EL，Kowey PR. Drug therapy for atrial fibrillation[J]. Med Clin North Am，2008，92：121-141.
[8] Kato T，Yamashita T，Sekiguchi A，et al. What are arrhythmogenic substrates in diabetic rat atria[J]. J Cardiovasc Electrophysiol，2006，17：890-894.
[9] Bruins P，Velthuis H，Yazdanbakhsh AP，et al. Activation of the complement system during and after cardiopulmonary bypass surgery：postsurgery activation involves C-reactive protein and is associated with postoperative arrhythmia[J]. Circulation， 1997，96（8）：3542-3548.
[10] Yu G，Zucchi R，Ronca-Testoni S，et al. Protection of ischemic rat heart by dantrolene，an antagonist of the sarcoplasmic reticulum calcium release channel[J]. Basic Res Cardiol，2000，95（2）：137-143.
（收稿日期：2011-09-01）
