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[摘要] 目的：探讨FAT对K562/A02细胞内谷胱甘肽（GSH）含量的影响，及其对白血病细胞代谢解毒系统介导的多药耐药（MDR）的逆转效果。方法：采用生化DTNB法测定细胞内谷胱甘肽水平。结果：K562/A02细胞内GSH含量（231.54 μmol/106细胞）高于K562细胞内GSH含量（58.03 μmol/106细胞），为K562细胞的3.99倍；VRP（10 μmol/L）、FAT（0.01、0.02、0.04、0.08 mg/ml）作用48 h后，K562/A02细胞内GSH含量从231.54 μmol/106细胞分别减少到96.95 μmol/106细胞、212.89 μmol/106细胞、161.00 μmol/106细胞、122.35 μmol/106细胞。结论：细胞内GSH含量增加是K562/A02细胞产生MDR的机制之一；FAT降低K562/A02细胞内GSH的含量是FAT逆转MDR的机制之一。
[关键词] 白血病；多药耐药；FAT；谷胱甘肽
[中图分类号] R-33 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2012）01（b）-005-02
Effect of FAT on K562/A02 intracellular GSH concentration
ZHANG Yuxia1, YONG Guoxin1, LIANG Qiong2
1.Department of Technology Application, Hainan Technology and Business College in Hainan Province, Haikou 570203, China; 2.Department of Engineering Technology, Haikou College of Economics in Hainan Province, Haikou 570203, China
[Abstract] Objective: To investigate the impact of FAT on K562/A02 intracellular glutathione (GSH) concentration, and leukemia cell metabolism system of detoxification mediated drug-resistant (MDR) reversal effect. Methods: Intracellular GSH concentration was examined by biochemical DTNB method. Results: Intracellular GSH concentration in K562/A02 cell line (231.54 μmol/106 cells) was higher than that in K562 cell line (58.03 μmol/106 cells), and 3.99-fold greater in K562/A02 cell line compared with in K562 cell line. Intracellular GSH levels in K562/A02 cell line treated with VRP (10 μmol/L), FAT (0.02, 0.04, 0.08 mg/ml) for 48 hours (96.95 μmol/106 cells, 212.89 μmol/106 cells, 161.00 μmol/106 cells,122.35 μmol/106 cells respectively) was decreased than that in K562/A02 cell line without FAT (231.54 μmol/106 cells). The intracellular GSH concentration in K562/A02 cell line was higher than that in K562 cell line. Conclusion: The intracellular GSH content increase in K562/A02 cells to produce MDR mechanism of K562/A02. One of the mechanisms of MDR reversal by FAT is decrease of intracellular GSH levels on K562/A02.
[Key words] Leukemia; Reversal of multidrug resistance; FAT; Glutathione
多药耐药（multidrug resistance，MDR）是恶性肿瘤化疗失败的重要原因之一[1]。过去20多年以来，科学家们纷纷从P-gp方面入手寻找有效逆转剂，但是由于P-gp抑制剂的强烈毒副作用使得其临床应用受到限制，目前没有一种P-gp抑制剂被美国FDA批准[2]。
还原型谷胱甘肽（GSH）是人类细胞质中自然合成的一种肽，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成，含有巯基（-SH），是细胞内抗氧化体系的重要组成部分，也是很多生物合成反应的还原剂，还参与细胞内很多重要的生物学功能，如外源物的排除、酶活性的激活与酶反应的耦联等[3]。刘明华等[4]研究表明，肿瘤细胞内GSH含量的增高与多药耐药（MDR）有关，耗竭谷胱甘肽可以逆转MDR。从GSH方面入手寻找高效低毒的多药耐药逆转剂目前已经成为肿瘤方面的热点。近年来甲基莲心碱[5-6]、青蒿琥酯[7]、穿琥宁[8]、五味子甲素[9]、盐酸千金藤碱[10]等通过降低多药耐药细胞内GSH含量从而提高对抗癌药的敏感性相继被报道。福安泰（FAT）是本实验室首次从我国南海海域生长的一种生物组织中分离出来的生物活性物质。本文采用了生化DTNB法来测定FAT对K562/A02细胞内GSH含量的影响，旨在探讨FAT对K562/A02细胞的逆转机制。
1 材料与方法
1.1 材料与设备
1.1.1 细胞系
K562/A02细胞和K562细胞分别由中国医学科学院血液研究所和中国科学院细胞生物学研究所提供。
1.1.2 试剂和药物
RPMI-1640粉（美国HyClone公司）；小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司产品）；ADM（美国Alexis产品）；NADPH、DTNB、酵母GSSG还原酶、磺基水杨酸（美国Sigma公司）；标准GSH（Amersco公司）。
1.1.3 主要仪器
TC2323CO2培养箱（美国Shellab公司）；UV-1601紫外分光光度仪（日本Shimadzu公司）；JY92-Ⅱ型超声波细胞粉碎机（宁波新芝科器研究所）；1-13微型高速离心机（美国Sigma公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养
参照鄂征[11]的培养方法，将K562细胞置于含10%小牛血清的RPMI 1640培养基中，在37℃、含5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养，隔天换液1次。
将K562/A02细胞置于含10%小牛血清的RPMI 1640培养基中，诱导药物阿霉素的浓度从低（0.6 μg/ml）到高（可达到2 μg/ml），最后在培养体系中加入终浓度为1 μg/ml的阿霉素（ADM）长期传代培养，以维持耐药性，培养条件同K562细胞，实验前无药培养2周。
1.2.2 DTNB法测定FAT对K562/A02细胞内GSH表达的影响
1.2.2.1 标准曲线的制作 取700 μl NADPH液加100 μL DTNB液中；对照管加200 μl去离子水；样品管加50、100、150 μmol/L的GSH标准液200 μl，加GSSG还原酶2 μl，混匀后，用紫外分光光度计测定吸光度，波长定于412 nm，如图1所示。
1.2.2.2 标本处理 取细胞形态良好、对数生长期的K562细胞和K562/A02细胞分别离心（600 rpm/min；5 min），弃上清，用含10%小牛血清的RPMI 1640培养基稀释细胞至5.6×105个/ml，再将细胞悬液接种于24孔培养板，900 μl（5×105个细胞）/孔，实验分组：①FAT 0.02 mg/ml；②FAT 0.04 mg/ml；③FAT 0.08 mg/ml；④VRP 10 μmol/L；按实验分组分别加入相应浓度的药物工作液100 μl/孔，混匀后在37℃、5%CO2、饱和湿度的条件下培养，同时取对数生长期的K562/A02细胞和K562细胞，不加逆转剂，作为对照，48 h后，收集细胞到离心管中，离心（1 500 rpm/min；2 min），弃上清液，用冷PBS洗3次，再加PBS调整细胞数为1×106/ml，用以测定 K562细胞和K562/A02细胞内GSH含量。取上述各组细胞数为1×106/ml的细胞悬液，经细胞破碎仪破碎细胞，1 000 g离心5 min，取上清液200 μl加100 μl 10%磺基水杨酸混匀，1 000 g离心5 min，去蛋白，用上清液200 μl去测OD值。方法同标准曲线的制作[12]。
1.3 统计学方法
实验数据用x±s表示，并用组间t检验分析差异的显著性。
2 结果
DTNB法检测结果（表1）显示：K562/A02细胞内GSH含量（231.54 μmol/106细胞）远远高于K562细胞内GSH含量（58.03 μmol/106细胞），为K562细胞的3.99倍；FAT可减少K562/A02细胞内GSH含量，VRP（10 μmol/L）、FAT（0.01、0.02、0.04、0.08 mg/ml）作用48 h后，K562/A02细胞内GSH含量从231.54 μmol/106细胞分别减少到96.95 μmol/106细胞、212.89 μmol/106细胞、161.00 μmol/106细胞、122.35 μmol/106细胞，但仍高于K562细胞内GSH含量，说明FAT可减少K562/A02细胞内GSH的表达，并且与剂量相关，但是效果没有VRP显著，趋势见图2。
3 讨论
肿瘤细胞GSH含量增高是导致MDR的原因之一，降低GSH水平可以提高肿瘤细胞对药物的敏感性，增强化疗疗效，逆转MDR。本试验显示了FAT作为有效多药耐药逆转剂的一些药理学特征：K562/A02细胞内GSH含量远远高于K562细胞内GSH含量，经无毒剂量的FAT作用后，K562/A02细胞内GSH含量减少，推测FAT可能通过减少GSH的表达或与GSH结合来降低细胞内GSH含量，并且与剂量相关。FAT对GSH酶系统如GST、GSH-Px、γ-GCS等的影响有待进一步研究。
[参考文献]
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（收稿日期：2011-08-31）
