【www.zhangdahai.com--工作心得体会】
[摘要]目的探讨脑低灌注对脑内tau蛋白的过度磷酸化和胆碱能指标变化的影响。方法40只SD大鼠随机分为低灌注组和假手术组，永久性阻断双侧颈总动脉制作脑低灌注模型；应用Y迷宫检测大鼠学习记忆能力，用免疫组化法检测大脑皮质和海马组织色氨酸404位点tau蛋白过度磷酸化(Pser404-Tau)和胆碱乙酰转移酶(ChAT)的表达，用考马斯亮蓝法检测海马组织乙酰胆碱酯酶(AChE)活性。结果脑低灌注术后14d和21d，大鼠学习记忆能力明显减退，与假手术组相比差异有统计学意义(P-1]腹腔注射(ip)麻醉，颈前正中切口，分离暴露双侧颈总动脉，注意避开与之同行的迷走神经，两侧颈总动脉均行丝线双重结扎并于两结扎点之间剪断血管。逐层缝合切口，消毒待醒。假手术组动物进行相应的手术步骤，分离暴露双侧颈总动脉，而不结扎血管。
1．4 行为学检测
应用MG-B电迷宫进行学习记忆能力测试，此为Y一型电迷宫，观察动物学会逃离电击区而进入安全区的反应能力。以大鼠被电击后从电击区一次性逃至安全区为“正确”，连续训练，记录大鼠达到“学会”(连续10次测试中9次正确为学会)标准所需的电击次数。行为学测试分别于术前、术后14d和21d检测3次，均于上午8：00～11：00进行。
1．5 脑组织标本的采集和固定
术后21d行为学测试结束后进行。每组10只大鼠用温生理盐水100ml及预冷的4％多聚甲醛400ml灌注鼠脑。取脑行后固定，应用AO恒低温切片机将固定好的脑组织从视交叉向后连续冠状切片，片厚8μm，每5张取1张贴片，-20℃冰箱保存待行免疫组化染色。另每组10只用于AChE活性检测，断头取脑，将脑组织在冰冷生理盐水中漂洗，除去血液，冰盘上快速取出海马，研磨成10％匀浆，4℃ 3500r・min-10离心10min，取上清液-20℃冻存待测AChE的活性。
1．6 免疫组化染色
Pser404-Tau和ChAT染色用SP法，Pser404-Tau-抗按1：100稀释，ChAT-抗按1：200稀释，免疫组化染色具体步骤依照SP试剂盒说明书进行，DAB呈色；ChAT免疫组化在DAB呈色后行苏木素复染。阳性细胞计数采用每只大鼠10张切片，光镜下(×400)每张切片计数4个视野的阳性细胞，总和除以4作为该大鼠的阳性细胞计数。
1．7 AChE酶活性检测
采用考马斯亮蓝法检测AChE活性。其原理是AChE水解乙酰胆碱生成胆碱及乙酸，胆碱可以与巯基显色剂反应生成TNB(对称三硝基苯)黄色化合物，根据颜色深浅进行比色定量，测算AChE的活力。
1．8 统计学处理
实验数据用X±s表示，采用SPSS11.5软件进行统计学分析。成组设计多样本均数的比较用one-way ANOVA检验，多样本均数与一组均数问的比较用LSD或Games-Howell检验。
2 结果
2．1 行为学检测
大鼠术前测试2组差异无统计学意义(P>0.05)，术后14d和21d测试2组差异有统计学意义(P 首先报道的一种神经系统变性疾病，其主要病理特征是老年斑(sPs)出现、神经原纤维缠结(NFT)和神经元的大量丢失。AD脑内神经元的丢失以胆碱能神经元为主，主要表现为记忆障碍、认知功能减退等胆碱能神经受损所致的高级神经功能紊乱。而AD病因和发病机制迄今尚无统一的认识，近年研究认为血管因素主导AD的发病，甚至认为AD本身就是一种有着神经元变性结果的血管源性疾病。本实验结果显示，脑低灌注术后脑组织发生了与AD相关的病理生理改变，即tau蛋白过度磷酸化，中枢胆碱能系统功能紊乱，认知功能下降。
3．1 脑低灌注触发脑组织AD样改变
临床流行病学研究显示，散发性AD患者多同时伴发脑血管疾病，AD患者早在出现痴呆症状之前，就已有明显的脑灌注不足及脑代谢降低，AD发病的危险因素可以阻碍脑部供血，而改善脑血液循环的药物多能够减轻AD症状，所有这些均提示AD的发病与脑缺血相关。近来更有实验研究显示，局灶性短暂性脑缺血后，脑组织卢淀粉样蛋白和JB淀粉样前体蛋白表达增加，9个月后生成了SPS，提供了脑缺血引发AD的直接证据。本实验中2VO模型鼠双侧颈总动脉被阻断，脑组织处于持续性低灌注状态，大脑皮质和海马发生了tau蛋白的过度磷酸化，这是AD发病的重要病理生理过程，神经元内过度磷酸化的tau蛋白聚集形成NFT，构成经典的AD特征性病理改变。脑低灌注大鼠大脑皮质和海马ChAT表达明显降低，提示胆碱能神经元受损或数目减少，推测由其催化生成的产物乙酰胆碱也减少，乙酰胆碱是重要的神经递质，与高级神经功能活动密切相关，故学习记忆能力减退。AChE活性更是反映胆碱能神经递质的重要指标，海马AChE活性降低，也提示中枢乙酰胆碱量的减少和胆碱能神经功能紊乱。脑低灌注可能通过这些途径引发AD发病。
3．2 脑低灌注与tau蛋白过度磷酸化
tau蛋白是一种微管结合蛋白，对维持神经元轴突中微管的稳定起重要作用。而过度磷酸化的tau蛋白一方面影响tau与微管的结合，破坏神经元中物质转运，神经元呈退行性变化；另一方面构成双股螺旋细丝，沉积在神经元内形成NFT，也参与神经细胞外SPS的形成。本实验中脑低灌注模型大鼠大脑皮质和海马Pser404-Tau表达增加，可能与脑低灌注时磷酸化状态的改变有关，局灶性脑缺血后也有类似现象。这也可能是脑血管病患者更易发生AD的原因之一。
3．3 脑低灌注与胆碱能神经损害
脑内的胆碱能系统损害在AD发病中起重要作用，胆碱能神经元丢失的严重程度与AD症状的轻重相关。AD患者尸检或脑活检显示，前脑基底核内胆碱能神经元变性以致死亡，突触前乙酰胆碱的合成、AChE和ChAT活力改变，突触后M受体数量减少。本实验中脑低灌注术后21d，大脑皮质和海马ChAT活性以及海马AChE活性明显降低，与人类AD脑内胆碱能神经功能改变相似。ChAT和AChE均是乙酰胆碱的代谢酶，由神经元胞体合成，推测脑低灌注状态下血氧供应下降，抑制了三羧酸循环，能量供应不足，而使ChAT和AChE合成减少；也可能是支配海马的基底前脑胆碱能神经元受缺血损害，突触数量减少所致。由于AChE活性部位是乙酰胆碱的阳性部位，AChE的作用底物是乙酰胆碱，故AChE活性的改变可直接反映乙酰胆碱的代谢情况，从而在一定程度上体现胆碱能系统的功能状况，即脑低灌注时胆碱能神经受损，乙酰胆碱减少，因此AChE活性降低。本研究结果提示脑低灌注明显损伤了模型鼠海马胆碱能神经功能。
随着对AD研究的不断深入，人们发现用任何单一的致病因子都不能圆满地解释其复杂的病理机制，AD病因学和发病机制尚需进一步研究。研究AD的血管病成因，有助于对AD触发因素及其实质的再认识，可能影响防治AD的策略。
