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【摘要】 目的 研究醛固酮阻滞对心肌梗死大鼠非梗死区心肌组织胶原重塑的影响。方法 将心肌梗死后24 h存活大鼠随机分为2组：盐水组(22只，5 ml/d)，螺内酯组(23只，20 mg/kg)；另设假手术组(15只)作对照。分别于心肌梗死后6周：导管法测定左室有创血流动力学；组织学方法检测胶原纤维沉积；化学比色法测定胶原含量；免疫组化法观察胶原Ⅰ/Ⅲ比值；RT-PCR检测Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原mRNA的表达。结果 ①所有心肌梗死大鼠均出现显著的心肌间质纤维沉积，左室重量指数增大，与假手术组相比差异有统计学意义(P[1]；但醛固酮阻滞对AMI后心肌组织Ⅰ型及Ⅲ型胶原重塑的影响鲜见报道。本研究旨在观察AMI大鼠Ⅰ型及Ⅲ型胶原重塑及醛固酮阻滞对其影响，研究醛固酮阻滞在心肌梗死后心室重塑的作用及机制。�
1 材料与方法�
1．1 材料 兔抗鼠Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原多克隆抗体、羊抗兔第二抗体(武汉博士德生物技术有限公司分装)；Ⅰ型胶原Ⅲ型胶原基因和内参照基因磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)引物(上海生工生物工程公司合成)；螺内酯片剂(杭州民生药业集团有限公司)。DH-50型小动物呼吸机(浙江大学医学仪器厂生产)，Medlab生物信号采集系统(南京美易科技公司)，电泳仪和转膜仪及图像分析系统(Bio-Rad)。�
1．2 研究方法�
1．2．1 模型复制与动物分组 成年雄性SD大鼠(购自中山大学医学实验动物中心，清洁级)100只，体质量250~300 g，将大鼠编号，按随机数字表随机分为假手术组(n=20)和AMI模型组(n=80)。�
AMI模型的制作[2]：以盐酸氯胺酮70 mg/kg腹腔麻醉，气管插管，小动物呼吸机辅助呼吸，有氧正压通气，频率70次/min，通气量7~8 ml/次。于左胸第4肋间逐层开胸，分离心包，暴露心脏，在肺动脉圆锥和左心耳间找到左冠状动脉，用7-0丝线于左心耳下缘2 mm处结扎左冠状动脉，逐层缝合胸腔，大鼠清醒后拔除气管插管，撤除呼吸机。假手术大鼠经历上述手术过程，仅在左冠状动脉下穿线，不结扎。�
将制作AMI模型后24 h仍存活的45只大鼠随机分为2组：①螺内酯组23只，螺内酯20 mg/(kg•d)溶于生理盐水中灌胃；②盐水组22只，生理盐水5 ml/d 灌胃。假手术组术后24 h存活15只。�
1．2．2 血流动力学检测 大鼠心肌梗死6周后，应用颈动脉插管法行血流动力学测定，大鼠以4%水合氯醛(400mg/kg体质量)腹腔注射麻醉，穿刺右颈动脉，成功后给予肝素化，连接压力换能器，推送动脉导管进入左心室腔，稳定20 min后测定心率(heart rate，HR)、左室收缩压(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左室舒张末期压(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)、左心室内压最大上升和下降速率(left ventricular ejection fraction，±dP/dtmax)。�
1．2．3 心肌梗死面积及心室相对重量的测定 经股静脉注入10%氯化钾3 ml,使心脏停搏在舒张期。取出完整心脏，冰生理盐水漂洗后滤纸吸干，去除心房、大血管及心包组织，用电子天平称取心室重量；沿室间隔分离左心室(包括室间隔)称重，计算与体质量的比值得出左室重量指数(left ventricular mass index，LVMI)。左室横断为3段，每段切取1．5 mm薄片，放入氯化三苯基四氮唑(TTC)中37℃水浴染色。多媒体彩色病理图文分析系统根据左室内外周长及瘢痕组织内外弧长度，计算左室梗死面积所占的百分比，取3者均值为该动物的梗死面积，梗死面积0．05)，结果见表2。�
2．2 螺内酯对AMI后脏器重量及血液动力学变化的影响 与假手术组相比，心肌梗死组大鼠6周后均出现左室重量指数增加，差异有统计学意义(P0．05)。�
2．5 螺内酯对AMI后非梗死区Ⅰ型与Ⅲ型胶原比值变化的影响 与假手术组的正常心肌相比，心肌梗死组的非梗死区的胶原Ⅰ/Ⅲ比值升高，差异具有统计学意义(P
2．6 螺内酯对AMI后非梗死区Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA变化的影响 与假手术组相比，心肌梗死组非梗死区Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA水平增加，差异有统计学意义(P[3]。心脏间质胶原含量的变化是导致VRM及CHF发生和进展的主要机制之一[4]。本实验结果显示，大鼠AMI 6周后的左室舒缩功能与非梗死区的胶原含量成负相关，提示胶原的重塑引起心肌间质纤维化，限制心肌活动，降低心室的顺应性，影响心肌的功能，是引起CHF的重要因素。轻度心肌纤维化使组织僵硬度增加，使心肌的舒张顺应性降低；中、重度心肌纤维化使心肌被分割包围，收缩力的产生和传导受到限制，心肌收缩能力亦降低。心肌纤维化亦促进心室的结构改变，从而影响心脏功能并加重心功能不全的进展[5]。同时，胶原沉积可限制除极波通过心肌的速度，对心肌组织的电稳定性产生负面影响，可导致心律失常[4-6]。�
AMI发生后，心肌间质胶原除了在含量上增加，其胶原Ⅰ/Ⅲ比值亦发生变化。Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原是心肌间质中的主要成分，Ⅰ型胶原为粗纤维，而Ⅲ型胶原为细纤维，AMI后胶原Ⅰ/Ⅲ比值的改变反映了胶原网架结构的改建，是导致VRM及进展为CHF的另一重要因素。本实验结果显示大鼠AMI �6周�后非梗死区胶原Ⅰ/Ⅲ比值明显增加，提示Ⅰ型胶原的合成比Ⅲ型胶原多，与有关研究结果一致[7-9]。AMI后非梗死区Ⅰ型胶原明显增加，一方面有助于提高心室壁抗张力强度，对抗增加的室壁张力，防止或减轻心室壁伸展，另一方面由于Ⅰ型胶原聚合成粗纤维，其硬度高，但弹性差，因此增加了心肌的僵硬度，影响左室舒缩功能。本实验结果显示左室舒缩功能与非梗死区的胶原Ⅰ/Ⅲ比值呈负相关。�
醛固酮系统在AMI后心肌胶原重塑中起重要作用[1]。既往的研究发现[10]，螺内酯治疗能显著抑制非梗死区心肌组织骨桥蛋白(osteopontin，OPN)的表达。OPN为一种细胞外基质蛋白，介导细胞-细胞和细胞-基质之间的相互作用。在心肌梗死、心力衰竭和高血压等疾病的病理发展过程中促进纤维化和心肌肥大，在心肌损伤后及容量或压力负荷过重的调节中起重要作用[11]。研究证明[12]OPN在纤维的形成及胶原的沉积中起到了重要作用。Matsui等[13]的研究表明，醛固酮拮抗剂可减轻野生型小鼠对血管紧张素Ⅱ诱导的血压升高反应和心肌纤维化，与OPN缺陷的小鼠表现相似，推测醛固酮可能通过促进OPN的表达起作用，Sam等[14]的研究发现，OPN在醛固酮诱发的心室重构包括左室扩张、纤维化及细胞凋亡中起重要作用。在高血压患者中发现[15]，醛固酮是影响OPN的独立因素。这些结果均提示调节OPN是醛固酮诱导心肌纤维化的重要机制之一，笔者既往的研究证实了这一点[10]。本研究进一步深入研究了醛固酮阻滞对AMI后心肌组织胶原重塑中Ⅰ型及Ⅲ型胶原的影响，研究发现，与盐水组相比，螺内酯治疗使非梗死区胶原纤维沉积减少、胶原总量减少、Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA水平降低、胶原Ⅰ/Ⅲ比值降低，从而改善心功能。�
参考文献
［1］ Matsui Y,Jia N,Okamoto H,et al.Role of osteopontin in cardiac fibrosis and remodeling in angiotensin II-induced cardiac hypertrophy.Hypertension,2004,43(6):1195-1201.�
［2］ Iwanaga Y,Hoshijima M,Gu Y,et al.Chronic phospholamban inhibition prevents progressive cardiac dysfunction and pathological remodeling after infarction in rats.J Clin Invest,2004,113(5):727-736.�
［3］ Silvestre JS,Heymes C,Oubenaissa A,et al.Activation of cardicaldosterone production in rat myocardial infarction:effect of angiotension Ⅱ receotor blockade and role in cardiac fibrosis.Circulation,1999,99(20):2694-2701.�
［4］ Sun Y,Weber KT.Infact scar:a dynamic tissue.Cardiovasc Res,2000,46(2):250-256.�
［5］ Weber KT,Sun Y,Guarda E,et al.Myocardial fibrosis in hypertensive heart disease:an overview of potential regulatory mechanisms.Euro Heart J,1995,16(supplC):24-28.�
［6］ Sun Y,John Zhang J,et al.Cardiac remodeling by fibrous tissue after infarction in rat.J Lab Clin Med,2000,135(4):316-323.�
［7］ 郑兴,章同华,秦永文,等.心肌梗死大鼠梗死区和非梗死区间质胶原重构.第二军医大学学报,1999,20(9):662-665.�
［8］ Wei S,Chow LT,Sham IO,et al.Left and right ventricular collagen type Ⅰ/Ⅲ ratios and remodeling post-myocardial infarction.J Card Fail,1999,5(2):117-126.�
［9］ Zhang P,Yang YJ,Chen X,et al.Effect of doxycycline on the expression of matrix metalloproteinase and tissue inhibitor of MMP in myocardium after acute myocardial infarction:an animal experiment with rats.Zhonghua Yi Xue Za Zhi,2004,84(15):1288-1293.�
［10］ 张玉玲,周淑娴,雷娟,等.血管紧张素Ⅱ及醛固酮阻滞对心肌梗死大鼠非梗死区心肌组织骨桥蛋白表达的影响.中山大学学报(医学科学版),2007,28(6):662-665.�
［11］ Trueblood NA,Xie Z,Communal C,et al.Exaggerated left ventricular dilation and reduced collagen deposition after myocardial infarction in mice lacking osteopontin.Circ Res,2001,88(10):1080-1087.�
［12］ Nemir M,Bhattacharyya D,Li X,et al.Targeted inhibition of osteopontin expression in the mammary gland causes abnormal morphogenesis and lactation deficiency.J Biol Chem,2000,275(2):969-976.�
［13］ Matsui Y,Jia N,Okamoto H,et al.Role of osteopontin in cardiac fibrosis and remodeling in angiotensin II-induced cardiac hypertrophy.Hypertension,2004,43(6):1195-1201.�
［14］ Sam F,Xie ZL,Ooi H,et al.Mice lacking Osteopontin exhibit increased left ventricular dilation and reduced fibrosis after aldosterone infusion.Am J Hypertens,2004,17(2):188-193.�
［15］ Kurata M,Okura T,Watanabe S,et al.Osteopontin and carotid atherosclerosis in patients with essential hypertension.Clinical Science,2006,111(5):319-324.�
