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[摘要] 目的 优化PCR程序,尝试用降落PCR扩增人类常染色体STR D15S128。方法 用普通PCR和降落PCR扩增人类常染色体STR D15S128。结果 普通PCR扩增产物有非特异带,降落PCR无非特异带。结论 降落PCR简化了普通PCR中摸索最适退火温度的过程,可以一步找到人类常染色体STR D15S128的退火温度,是一种高效率的PCR方法。
[关键词] D15S128;降落PCR;退火温度;PCR特异性
[中图分类号] Q781 [文献标识码] A[文章编号] 1673-9701(2010)02-38-02
Touchdown PCR for Amplification of Human Autosomal STR D15S128
ZHANG YanpingGUO DaweiMA Lili
College of Forensic Medicine of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China
[Abstract] Objective To optimize PCR program and try to amplify human autosomal STR D15S128 by touchdown PCR(TD-PCR).Methods We used both common PCR and TD-PCR to amplify human autosomal STR D15S128. Results Ordinary amplification showed non-specificity band and TD-PCR showed no non-specificity band. Conclusion Compared with ordinary PCR,TD-PCR is simple and effective.
[Key words] D15S128;TD-PCR;Annealing temperature;PCR specificity
PCR(polymerase chain reaction)是法医物证检案中常用的方法[1],是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖DNA聚合酶的酶促反应[2];自1985年问世以来,因其特异性、有效性和忠实性在许多方面得到了广泛的应用。但在实验室日常工作中经常出现两种情况:①未找到最佳扩增条件,产生大量非特异产物;②未扩增出任何产物导致假阴性结果。影响PCR的因素很多:PCR仪器性能、反应体系(Mg2+、dNTP、引物、模板等)、反应条件(退火温度、循环次数、反应时间等),其中退火温度的影响最大[3]。降落PCR(touchdown PCR,TD-PCR)主要用于扩增退火温度不确定的基因,通过设计多循环使相连循环的退火温度越来越低,从而达到最佳扩增条件,减少非特异性扩增和假阴性结果的产生[4]。本实验采用普通PCR及降落PCR两种方法扩增人类常染色体STR D15S128,结果显示降落PCR效果良好,能特异、敏感、快速检测人类常染色体STR D15S128。
1材料和方法
1.1实验材料
山西汉族无关人群外周血,大连宝生物公司生产的普通Taq酶、10*Buffer、MgCl2、dNTP、Maker;引物由北京博迈德公司合成。
1.2基因组DNA提取
取山西汉族若干无关人群外周血各1mL,采用常规的酚-氯仿抽提法提取基因组DNA。
1.3引物设计
本研究依据ncbi中提供的此位点全基因序列(登录号为Z17197),应用primer5自行设计引物,扩增的目的片段在172～180bp,引物序列如下。
上游aaaaatatggccatgcaaca Tm 59GC%35%
下游gacaggcaagccagtggaga Tm 62GC%60%
1.4PCR扩增
1.4.1普通PCR扩增程序本实验室普通PCR反应体系:20μL反应体系含Buffer 2μL(内含Mg2+)、Taq酶(TaKaRa)1U、基因组DNA 1μg、dNTPs 0.4μL(10M)、上下游引物各0.8μL(20μmol/L),加双蒸水水至20μL;扩增程序:94℃预变性5min;94℃50s,56℃(或58℃,60℃)45s,72℃50s,28次循环;72℃10min。PCR产物用2%琼脂糖和8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
1.4.2降落式PCR(touchdown PCR)扩增程序降落PCR反应体系同上。降落PCR扩增程序:94℃5min;94℃50s,63℃45s,72℃50s循环5次;94℃50s,61℃45s,72℃50s循环5次;94℃50s,59℃45s,72℃50s循环5次;94℃50s,57℃45s,72℃50s循环5次;94℃50s,56℃45s,72℃50s循环8次;72℃10min。PCR产物用2%琼脂糖和8%聚丙烯凝胶电泳检测。
1.5电泳
由于STR用于法医检测时需要准确分型,而琼脂糖分辨率低,所以PCR产物先用琼脂糖初筛,再用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。2%琼脂糖(1*TBE缓冲液)凝胶,点样量为3μL;8%聚丙烯酰胺凝胶,点样量为1μL。
2结果
2.12%琼脂糖凝胶电泳结果
由于琼脂糖分辨率较低,普通PCR扩增结果与降落PCR扩增结果在琼脂糖凝胶电泳中无明显差别。结果见图1,其中M为Marker;1,2,3为普通PCR扩增结果;4,5为降落PCR扩增结果。Marker从下向上分别为50、100、150、200、250、300、400、500;最亮的一条为200,目的片段为172～180bp,介于150到200之间,最下面为引物二聚体,在PCR过程引物二聚体是难以避免的,不影响分型。
2.28%聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
2.2.1本实验室常规普通PCR扩增结果图2中1、2、3为普通PCR扩增结果。可以看出,普通PCR扩增出两个条带,一条为目的条带,一条为杂带。
2.2.2降落PCR(touchdown PCR)扩增结果图2中4、5、6为优化降落PCR法扩增结果,M为Marker,Marker 从下向上分别是150、200,目的片段为172～180bp,4,5,6正好落在两条marker之间。可以看出,目的区以外的非特异性带未出现杂带,说明用该方法获得了特异性较高的产物,提高了PCR对目的基因扩增的有效性。
3讨论
1991年Don等[6]报道TD-PCR是对PCR方法的优化。他认为,PCR过程中的前几个循环对于扩增产物的纯度非常重要,因此前几个循环较高的退火温度,会增加引物与模板结合的特异性,阻止非特异性产物的形成[6];与普通PCR操作基本一样,只是编设一系列退火温度从较高温度开始逐步降低的循环反应程序,获得理想的扩增效果。TD-PCR技术的基本原理为[6]:根据引物的Tm值,设置一系列从高至低的退火温度,开始选择的退火温度高于估计的Tm值,随着循环的进行,退火温度逐渐低至Tm值,并最终低于Tm值。这一策略可保证引物与模板杂交发生在最互补的反应物(目的扩增片段)之间,任何不同的变性温度与不同复性温度之间循环,能得到2倍增高的正确或不正确的产物,在随后的退火温度继续下降的过程中,上述的延伸合成会继续进行。当达到引物与模板结合的Tm值时,扩增开始,当降低到非特异性扩增发生的水平时,特异产物会有一个几何级的起始优势,在剩余反应中,特异产物具有绝对竞争优势,从而使其在扩增中占主导地位,提高其特异性[6]。降落PCR代表了一种不同的优化策略,通过在一个程序中采取一系列不同的退火温度进行扩增循环。考虑扩增特异性和扩增效率,在TD-PCR过程中一般需要采用热启动的方法。如果观察到许多产物带,可提高TD-PCR的最高退火温度和最低退火温度,使其范围上移;减少最低退火温度的循环次数,使各退火温度下的循环次数增加一个或几个,同时减少较低温度或恒定退火温度循环的次数。如果未检测到产物或产物带很弱,可将反应产物在恒定退火温度下再反应10个循环并重新分析。
普通PCR和TD-PCR相比,TD-PCR不仅仅是一种优化PCR条件的方法,更是一种潜在的一步法达到优化扩增的方法。普通PCR程序简单,一般的PCR仪都可以完成,但缺点是退火温度不适当时容易出现假阴性或产生很多杂带,为了得到满意的PCR结果,还需要经过一系列的试验优化扩增条件,这些过程需要花费大量的时间、精力和物力;而TD-PCR虽然程序复杂,需要PCR仪有较大的内存,但能非常有效的降低或避免假阴性,且在不理想的扩增体系(比如最佳Mg2+浓度)下增加特异性目的产物的产量,一步法达到优化扩增,大大提高工作效率。
本研究采用普通PCR及降落PCR两种方法对D15S128进行扩增,比较了两种方法的扩增效率和产物产量的扩增策略。由于此引物上下游Tm有一定差距,GC含量也相差较多,尽管不断改变退火温度(56℃、58℃、60℃),普通PCR总有非特异性产物。应用TD-PCR法对此基因座进行扩增,并没有摸索最佳退火温度,直接设计PCR扩增程序后,即顺利扩增出了目的片段,而且特异性条带和目的片段大小一致;表明在对人类常染色体STR-D15S128基因座进行扩增时,TD-PCR法显著优于普通PCR法。
通过本实验可以看出TD-PCR能用于降低或避免以下原因所致的非特异性扩增:短序列引物,Mg2+浓度不适当,Tm值相距较远的一对引物,GC含量相差较多,复杂的模板DNA,如基因组DNA。我们应用TD-PCR很好的避免了普通PCR所出现的非特异性扩增,为D15S128基因座的分型提供了快速、特异、可靠的方法。
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(收稿日期:2009-09-18)
