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摘 要：目的：鉴定不同年龄大鼠培养海马神经元的衰老细胞鉴定。方法：取6月龄和18月龄雄性SD大鼠海马进行原代海马神经元培养，分别在培养6d、10d和14d利用衰老相关的β半乳糖苷酶（Senescence associated β-galactosidase，SA-β-GAL）进行细胞化学染色。结果：18月龄培养10d和14d的海马神经元 SA-β-GAL染色较6月龄培养6d的海马神经元明显增多(�p�＜0.001)。结论：老年大鼠海马神经元体外培养进入衰老状态的时间较青年大鼠早。�
关键词：海马神经元；衰老；衰老相关的β半乳糖苷酶�
中图分类号：R339.3文献标识码：A文章编号：1673-2197（2008）07-009-02��
衰老相关的β半乳糖苷酶（Senescence associated β-galactosidase，SA-β-GAL）是目前被广泛采用的一种生物学标记物，它在衰老细胞中表达升高，因此成为鉴定细胞衰老的一个标志［1，2］。值得提出的是，有些衰老的生物学标记并不具有普遍性，SA-β-GAL作为一个衰老的生物学标记在体外检测复制衰老的细胞已经得到了广泛的认可［3］，但其是否能够用于检测衰老神经元，目前尚未得到证实，因此在应用上应加以验证。目前对衰老细胞的研究，衰老细胞从形态学上表现为细胞变大，变扁平［4］，然而在除此以外还有端粒变短，细胞周期停滞等特征，而鉴于神经元属于静止细胞，因此在衰老细胞鉴定生物学标记的选择时具有特异性，本研究拟对培养不同天数的海马神经元进行SA-β-GAL染色，从而鉴定衰老的海马神经元，同时验证SA-β-GAL在海马神经元应用的可靠性。�
1 材料与方法�
1.1 海马神经元原代培养�
分别取6月龄及18月龄雄性SD大鼠各2~3只，进行海马神经元原代培养。取海马组织：全身75%酒精消毒，断头取脑，将整个脑组织置于冷的HBSS(无Ca2+Mg2+)平衡液中，利用弯头玻璃棒将两侧海马完整取出。HBSS液洗4次，去除混杂的血管和血液。胰酶消化：用剪刀将海马组织剪成1mm3的小块，用HBSS洗4次，0.25%的胰酶37℃消化15min。终止消化：加入终浓度为10%的胎牛血清孵育5min终止消化，随后用HBSS洗4~5次去除残留的胎牛血清。吹打细胞：在15mL离心管中加入5mL Neurobasal A用Pasteur管吹打组织碎块，将浑浊的上清液收集到另一个15mL离心管中，200g离心10min，弃上清。接种细胞：沉淀用Neurobasal A液加B27重悬，在24孔板中接种在100mg/mL poly-L-lysine处理过的盖玻片上，密度约5~8×105cells/mL，在37℃，5%CO2培养箱中培养。在培养第五天加入10mmoL阿糖胞苷抑制胶质细胞和纤维母细胞生长，从接种第六天起可进行实验。�
1.2 SA-β-GAL的细胞化学检测�
分别取细胞接种后第6d、10d和14d的培养神经元在4%的多聚甲醛中室温固定15min，-20℃保存。接种细胞的盖玻片在室温下放置约30min，用X-Gal洗液（100mM磷酸钠；2mM MgCl2；0.01%脱氧胆酸钠）洗三次，每次15min，用X-Gal染液（100mM磷酸钠，2mM MgCl2，150mM氯化钠，0.01%脱氧胆酸钠，0.02% NP-40，5mM铁氰化钾，5mM亚铁氰化钾，1mg/mL X-gal）在37℃避光16~18h，PBS清洗3次，0.1%核固红室温复染20min。晾干后中性树胶封片，光镜下观察，拍片，计数。�
2 结果�
SA-β-GAL阳性率均随着培养时间延长而增加，在培养6d的神经元SA-β-GAL阳性表达较少，而在10d和14d的神经元中表达明显增加(�p�＜0.001)，同时培养10d的18月龄组比6月龄组阳性率明显增加（�p�＜0.05），然而在培养14d时两组阳性率差别不明显，表1所示。�
3 讨论�
本研究结果提示，随着培养时间的延长，成年海马神经元中的衰老神经元明显增加，与新生大鼠海马神经元培养相比，成年大鼠神经元存活时间较短，出现SA-β-GAL阳性染色的时间较早（未发表）。在本研究中发现老年大鼠在海马神经元的体外培养中，出现SA-β-GAL标记的衰老细胞较青年大鼠早，然而在延长培养后期，衰老细胞已趋向于饱和，而此时差别并不明显。SA-β-GAL是目前比较普遍应用的衰老生物学标记物［1］，多数的研究应用于复制衰老，而复制衰老是指真核细胞在完成有限分裂次数后，丧失合成DNA的能力，导致增殖能力丧失而仅维持细胞基本的代谢能力的状态，比较经典的复制衰老的细胞模型是人二倍体细胞（human diploid fibroblasts，HDFs）［2，5］。然而，神经元属于静止细胞，在体外培养中不再增殖和分裂，并且在体外研究中建立稳定可靠的衰老神经元的模型是研究中枢神经系统衰老的基础，SA-β-GAL在成年大鼠神经元培养中的成功应用，不仅使细胞培养的来源更加广泛，并且缩短了研究周期。除SA-β-GAL标记外，衰老的细胞还具有细胞变大，变扁平的形态学特点，然而在本研究中，延长培养的神经元形态学改变不明显，因此SA-β-GAL是一个比较敏感的生物学指标，在以往的研究中，我们分别在不同年龄大鼠的大脑皮层和海马区应用了SA-β-GAL标记了衰老神经元［6，7］，本结果利用体外培养的方式进一步验证了结果的可靠性。�
参考文献：�
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（责任编辑：陈涌涛）�
Identification of Senescent Cultured Hippocampal Neurons� from Adult Rats�
Geng Yiqun1，2，Fu Yucai2，Xu Xiaohu2�
(1. Shantou University/Hong Kong Chinese University Joint Shantou �International Eye Center，Guangdong Shantou 515041，China�
2. Shantou University Medical College，Guangdong Shantou 515041，China)�
Abstract： Objective：To identify senescent hippocampal neurons in cultured cells from different age of rats. Method： Standard hippocmapal neurons culture was performed from 6-month and 18-month SD male rats. Senescence associated β-galactosidase (SA-β-GAL) staining was applied to 6th，10th and 14th day of culture. Results：SA-β-GAL staining of neurons of 10th and 14th day of culture from 18-month rats was much stronger than that of 6th day of culture from 6-month rats (�p�＜0.001). Conclusion： Senescent marker shows cultured hippocamal neurons from older rats enter senescent status earlier than that from younger rats.�
Key words： Hippocampal neuron; Senescence; Senescence associated β-galactosidase
