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【摘要】 目的 在不吸出培养基的前提下，探讨MTT比色实验最佳溶解条件，以提高检测灵敏度和稳定性，降低本底，为悬浮细胞活性检测打下基础。方法 在96孔板接种不同密度肿瘤细胞，用MTT比色实验来测定。比较不同溶解液溶解Formazan能力，并与传统溶解液进行比较。结果 当用10% SDS(pH4~5)作为溶解液所得OD值与细胞数目很高的相关性，43 h后测定与12 h后测定所得OD值差异无显著性。结论 在MTT实验中，可以用10% SDS(pH4~5)作为溶解Formazan的溶解液，与传统溶解液相比可提高检测灵敏度、稳定性和降低本底。�
【关键词】 MTT比色法；SDS；细胞活性
The condition optimization of detecting cell activity
BO Hua-ben,SHAO Hong-wei,HU Ling-bo，et al. School of life science and biopharmacology,Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 510006 China
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【Abstract】 Objective To discussing the best dissolved conditions of the MTT colorimetric assay without discarding medium in order to enhance sensitivity,stability and lower background.Methods Inoculating the different density tumor cell in 96-well plates,detecting the tumor cell using MTT colorimetric assay.And dissolve the Formazan using different solutions.Contrast the dissolve capability of the different solutions.Results The OD value has high stability and correlation when Formazan was dissolved using 10% SDS(pH4-5).Conclusion In the MTT colorimetric assay,Formazan can be dissolved using 10% SDS(pH4-5).And the new solutions can enhance sensitivity,stability and lower background.�
【Key words】
MTT colorimetric assay;SDS;Cell activity
细胞活性检测方法很多，如细胞计数法、结晶紫法、单细胞克隆法、3H-TdR法和MMT法等[1]。MTT法以其简便、灵敏、稳定、重复性好而广泛用于检测培养细胞的生长和增殖、评价化学物的细胞毒性以及恶性肿瘤的体外药敏试验[2]。近年来MTT法已取得丰硕成果，因其更接近于临床，而更具有实用价值[3]。有助于临床医师制定合理的化疗方案，进而提高化疗疗效[4-5]。�
MTT比色法实验中，MTT的代谢产物formazan为水不溶性的，必须采用合适的有机溶剂溶解后，才能通过酶标仪或分光光度计进行检测。通常的方法是，加入MTT培养4 h，后吸出培养基，加入DMSO溶解formazan后比色测定。但去除培养基的操作较为繁琐，且易引起一定的实验误差，特别是对悬浮生长细胞，其应用受到一定的限制。如果不去除培养基，培养基中的血清和酚红会影响实验结果。针对这种情况有人提出使用无血清无酚红的培养基，但酚红是一种pH中性指示剂，血清是细胞生长必需的营养成分，两者都是细胞培养液的基本成份，因此这种操作比较繁琐。为了消除培养液中血清和酚红的影响，有人进一步提出在不吸出培养基的前提下，利用酸化异丙醇、酸化10%SDS[6]、20%的SDS-DMF酸性溶解液(pH=2．0)[7]和14%SDS-DMF酸性溶液(pH=4．7)[8]直接溶解formazan，都取得了不错的效果。但是Francois(1986)认为酸化异丙醇溶解formazan改变了原光谱特性，降低了灵敏度。我们在实验中发现报道的酸化10%SDS法也存在不足，本文针对其不足对其进行了改进，取得了良好的效果。
1 材料和方法
1．1 细胞株 人肝癌7402细胞株为本实验室保存。
1．2 主要仪器和试剂 Model680型酶标仪(BIO-RAD)，Heλios型紫外可见分光光度计(Thermo)，MTT(Amresco)，SDS(Sigma)，RPMI-1640培养液(Invitrogen)，胎牛血清(天津灏洋)
1．3 Formazan溶液最大吸收波长 人肝癌7402细胞以2×105/ml的细胞密度接种于24孔培养板，每孔1 ml，培养4 h后，按10：1(v/v)的比例每孔加入MTT(5 mg/ml)，细胞培养箱孵育4 h后，分别向各孔加入1 ml不同pH值(pH=2、3、4、5)的10%SDS溶解液，后细胞培养箱孵育。12 h后对上述各孔进行400~700 nm光谱扫描。
1．4 最佳formazan溶解液 培养人肝癌7402细胞胰酶消化后，稀释成五个梯度，浓度分别为：3．5×105个/ml，2．8×105个/ml，2．24×105个/ml，1．79×105个/ml和1．43×105个/ml。把上述细胞悬液分别接种96孔板，每孔100 μl，后细胞培养箱放置4 h使细胞贴壁，按10：1(v/v)的比例每孔加入MTT(5 mg/ml)，细胞培养箱孵育4 h，然后向每孔分别加入100 μl不同pH值(pH=2、3、4、5)的10%SDS溶解液。继续置细胞培养箱孵育，12 h后酶标仪测570 nm OD值，以后每隔2 h测OD570 nm值1次。每孔设6个复孔。其中pH为2时的溶解液为传统formazan溶解液。
1．5 统计学方法 采用SPSS12．0软件，进行回归分析和单因素方差分析。作图采用EXCEL软件。
2 结果
2．1 Formazan最大吸收波长 人肝癌7402细胞以2×105/ml的细胞密度接种于24孔培养板，对四种不同pH值(pH=2、3、4、5)溶解液所得液体，分别与400~700 nm进行光谱扫描(图1)，从图中我们可以看出，不同pH值时，除了吸收值随pH的升高而升高以外，在570 nm左右都有一个比较宽的吸收峰。
2．2 最佳formazan溶解液 把不同溶解液所得各细胞浓度的OD570 nm值与细胞数目用EXCEL软件作直线回归线(图2)，从图中可以看出，4种不同溶解液所得formazan溶液的OD570 nm值与相应细胞数目都成直线回归。可以发现溶解液的pH为2时，回归系数比pH为3、4、5时要小，可以推断溶解pH2时会降低检测灵敏度。通过SPSS统计软件对回归系数进行了方差分析和t检验，结果回归系数间差异有统计学意义，P 利用SPSS统计软件对四种formazan溶解液所得溶液的稳定性进行了分析(表1)，从表中可以看出，当溶解液的pH值为2、3时，溶液16 h后测定与12 h测定所得数值有显著性差异，而当溶解液的pH值为4、5时，溶液43 h测定与12 h后测定所得数值无显著性差异。
3 讨论�
现行的MTT法其关键的问题是MTT的代谢产物formazan为不溶于水的结晶物，通常在加入有机溶剂前需吸净全部的培养基，这不仅操作较为繁琐，而且也容易产生一定的实验误差，同时对悬浮生长细胞的应用也起到一定的限制。本文在前人工作的基础上，对MTT法做了进一步的探索，使其更适于在不吸出培养基的情况下溶解formazan。首先，通过对不同pH值下RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清，0．5 mg/ml MTT)进行波长扫描，发现要消除培养基对吸收值的影响，要使溶解液的pH值小于等于5。这是因为酚红在pH大于5时在560 nm左右有吸收峰。因此我们确定formazan溶解液的pH值必须小于等于5，才能消除培养基带来的干扰。�
其次，对不同formazan溶解液下所得溶液进行全波长扫描，得出以下结论：formazan溶解液没有改变formazan的吸收特性，所得溶液在570 nm左右都有一个比较宽的吸收峰，因此决定在570 nm进行检测。�
最后，通过对不同formazan溶解液所得溶液与相应数目细胞的相关性分析，和所得溶液的稳定性分析。发现当formazan溶解液的pH值在4~5时，灵敏度最高、相关性最好、溶液最稳定。�
MTT法作如上改进有如下优点：可使用普通培养基，无需特别选购无酚红无血清培养基；formazan溶解完全，溶解液稳定；细胞数量与光吸收值线性关系良好；本底低，灵敏度高，稳定性好。�
参考文献
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