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[摘要] 目的 本课题旨在研究2型糖尿病大鼠心脏血管紧张素II的变化及其影响，并探讨其机制。方法将雄性SD （Sprague Dawley）大鼠分为两组，糖尿病组高糖高脂喂养，用小剂量（40mg/kg）链唑霉素腹腔注射诱导成为2型糖尿病大鼠模型；对照组普通饲料喂养，腹腔注射柠檬酸缓冲液；再将糖尿病组分为两组，一组灌胃生理盐水（0.5mL/（kg・d），一组灌胃雷米普利水溶液（1mg/（kg・d），灌胃8周后，检测心功能的各项参数指标，测定血浆与心肌组织中血管紧张素II（AngⅡ）的含量，测定心肌Caspase-3活性，测定血清肌酸激酶同工酶（CK-MB）、心肌肌钙蛋白I（cTnI）含量，测定心肌组织中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量。结果同对照组比较，2型糖尿病组血浆与心肌组织中的AngII含量明显升高，心功能LVSP、dp/dtmax明显下降、LVEDP明显升高，Caspase-3、CK-MB 、cTnI、MDA均明显升高，SOD明显降低；与灌胃生理盐水组相比，灌胃雷米普利组血浆与组织中AngII含量明显降低，心功能dp/dtmax明显升高、LVEDP明显降低，Caspase-3、CK-MB 、cTnI、MDA均明显降低，SOD明显升高。结论 血管紧张素II升高参与了糖尿病时�糖高脂所介导的心脏功能受损、心肌细胞损伤，因此通过对AngII的抑制，可以对2型糖尿病引起的心脏损伤起到一定的保护作用。
[关键词] 2型糖尿病；血管紧张素II；心脏
[中图分类号]R587.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2011）19-12-04
Protection Mechanism of Angiotensin Inhibitors on Cardiac Injury in Rats with Diabetes
ZHANG ZhongYANG YanhongJIAO Xiangying
Anatomic Department, Cytophysiology Key Laboratory ofShanxi Medical University of Common Foundation by Shanxi Province and Ministry of Education , Taiyuan 030001,China
[Abstract] Objective To studytheprotection mechanism of angiotensin inhibitors on cardiac injury in rats withtype 2 diabetes. Methods Male Sprague Dawley (SD) rats were divided into two groups, high-sugar high-fat fed diabetic group, with a small dose (40 mg / kg） intraperitoneal injection of streptozotocin induced rat model of type 2 diabetes to become; control group of ordinary diet, intraperitoneal injection of citrate buffer; Diabetic group and then divided into two groups, one group was given normal saline （0.5mL/（kg・ d）), one group was given ramipril solution(1mg/(kg・ d）), eight weeks after gavage, test heart function The parameters and measured plasma and cardiac tissue angiotensin Ⅱ （Ang Ⅱ) content of myocardial Caspase-3 activity, serum creatine kinase（CK-MB）, cardiac troponin Ⅰ （cTnI ) Content of myocardial superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA) content. Results The Results showed that compared with the control group, type 2 diabetes, plasma and myocardium Ang Ⅱ was significantly higher in heart function LVSP, dp/dtmax decreased, LVEDP increased significantly, Caspase-3, CK-MB, cTn1, MDA were significantly increased, SOD significantly decreased; and intragastric saline group, fed the blood ramipril award and tissue Ang Ⅱ were significantly decreased heart function dp/dtmax increased significantly, LVEDP decreased, Caspase -3, CK-MB, cTn1, MDA were significantly decreased, SOD significantly increased. ConclusionAngiotensin Ⅱ increased in the diabetes high glucose and lipid-mediated impaired heart function, myocardial cell damage, through inhibition of Ang Ⅱ may be due to type 2 diabetes, heart damage play a protective role.
[Key words] Type 2 diabetes;Angiotensin Ⅱ; Heart
糖尿病是由于胰岛素绝对或相对不足所引起的一种以糖脂代谢紊乱为主要表现并波及多个器官的慢性代谢疾病。近年来，糖尿病的发病率、死亡率明显上升，长期的糖脂代谢异常可引起多个器官发生病变，其中以心脏并发症最为多见，是糖尿病患者死亡的主要原因，可达55%[1]，糖尿病已继高血压之后成为威胁我国公共卫生健康的重要问题之一。
近年来有研究表明，在糖尿病患者体内全身和局部的血管紧张素Ⅱ升高，抑制其生成可以减少糖尿病的发生率及糖尿患者心血管疾病的死亡率，但其确切作用和机制不明[2,3]。本课题尝试采用临床上广泛使用的、成熟的治疗高血压药物血管紧张素Ⅱ的抑制剂来治疗糖尿病心肌细胞损伤，并从各方面对其作用机制进行研究探讨，为临床探索糖尿病的治疗用药提供理论依据，为降低糖尿病的罹患率和死亡率、保护人们的生命健康，促进整个社会的和谐健康发展提供帮助。
1材料与方法
1.1 试剂和仪器
大鼠胰岛素（Insulin）、血管紧张素Ⅱ (angiotensinⅡ,AngⅡ)、血清肌酸激酶同工酶(creatine kinase MB, CK-MB)、心肌肌钙蛋白I (cardiac troponin I, cTnI)ELISA试剂盒均购自美国ADL 公司；超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase SOD）、丙二醛（Maleic Dialdehyde MDA）、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒均购自南京建成公司；雷米普利（Ramipril Tablers）（5mg/片）购自昆山龙灯瑞迪制药有限公司；血糖仪采用美国强生OneTouch血糖仪；AFC标准品、Ac-DEVD-AFC荧光底物均购自BIOMOL 公司；Emax酶标仪，美国Molecular Devices公司]。
1.2 动物与分组
雄性Sprague Dawley (SD)大鼠40 只(由山西医科大学实验动物中心提供)，体重160～180 g，随机分为两大组：糖尿病组30只、对照组10只。其中糖尿病组经(普通饲料中加入10%猪油、10%蛋黄粉、20% 蔗糖)喂养4周后，一次性腹腔注射链脲佐菌素 (streptozocin， STZ，40 mg/kg，溶于柠檬酸缓冲液，pH 4.5)造模，造模成功后继续用高糖高脂饲料喂养；对照组经普通饲料喂养4 周后，给予腹腔注射等量柠檬酸缓冲液。注射STZ后1周经尾静脉采血测空腹血糖浓度(fasting blood glucose, FBG)，FBG≥16.7mmol/L者确定为糖尿病大鼠造模成功[4]。造模完成后将糖尿病组分成两组，灌胃生理盐水组[0.5mL/(kg・d）]15只、雷米普利水溶液(1mg雷米普利溶于5 mL生理盐水中)组[1mg/(kg. d)]15只，灌胃8周后观察大鼠的心功能、Ang Ⅱ等指标。
1.3 大鼠血糖浓度、血清胰岛素的测定
分别于造模前和注射STZ后1周及灌胃8周后进行大鼠断尾采血(采血前大鼠禁食12 h)，测定血糖浓度；同时取血静置后，3000 r/min离心10 min制备血清，按大鼠胰岛素ELISA试剂盒说明测定各时间点大鼠血清胰岛素含量。
1.4 大鼠心功能测定
大鼠腹腔注射20%氨基甲酸乙酯（1g/kg）麻醉，颈部切口后，经右侧颈总动脉插管至左心室，导管的另一端连接P50压力换能器，压力信号输入MS2000生物信号记录分析系统。导管插入左心室后稳定15～20min记录心功能各项参数：心率（HR）、左心室收缩压（leftventricularsystolicpressure，LVSP）、左心室内压上升最大速率（dp/dtmax）及左心室舒张末期压（left ventricular end diastolic pressure,LVEDP）。
1.5 AngⅡ、CK-MB、cTnI含量测定
抽取大鼠外周静脉血(肝素抗凝)0.5 mL，静置分层后，3000r/min离心10min，吸取上清制备血清；取心肌组织，按1mg组织加入10μL双蒸水，至冰上剪碎，匀浆，离心制备组织匀浆。分别按相关ELISA试剂盒说明测定血清AngⅡ、CK-MB、cTnI 含量及组织AngⅡ的含量。
1.6 心肌caspase-3活性测定
Caspase-3的活化是细胞凋亡的最终共有途径，其活性可以反映凋亡发生的程度。活性测定基本步骤如下[5]：取心肌组织，按1mg组织加入10μL 裂解液的比例进行裂解，置冰上剪碎，匀浆，离心。上清用考马斯亮蓝试剂盒测定蛋白浓度。取上清、反应缓冲液，底物(Ac-DEVD-AFC)加至ELISA板中水浴后，用酶标仪405nm下测定光密度值，同时ELISA板中加入不同浓度AFC作为标准品读数后作为标准曲线，各样品caspase-3活性结果以每毫克心肌蛋白单位时间分解底物产生AFC的速度来表示。
1.7 心肌组织MDA、SOD含量测定
取心肌组织，按1mg组织加入10μL双蒸水，至冰上剪碎，匀浆，离心取上清，用考马斯亮蓝试剂盒测定蛋白浓度，并分别按相关试剂盒说明测定MDA、SOD含量。
1.8 统计学处理
采用SPSS13.0统计软件对数据进行分析，实验结果以（χ±s）表示，组间均数比较采用单因素方差分析，样本均数组间比较采用q检验，P＜0.05 时认为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 血糖浓度、血清胰岛素水平变化
饲养前及饲养4周时各组间FBG均无明显差异；注射STZ 1周后，糖尿病组FBG均＞16.7mmol/L，且较对照组显著升高（P＜0.01） ，表明糖尿病造模成功。糖尿病组大鼠血清胰岛素与对照组比较也显著升高（P＜0.01）。见表1。结果提示，本实验建立的糖尿病大鼠模型具备高血糖、高胰岛素血症等2型糖尿病的主要临床特征，显示2型糖尿病模型建模成功。灌胃8周后，糖尿病生理盐水组、糖尿病雷米普利组FBG较对照组均显著升高（P＜0.01），糖尿病生理盐水组胰岛素较对照组显著升高（P＜0.01），糖尿病雷米普利组较对照组与糖尿病生理盐水组均无统计学差异（P＞0.05）。结果提示，经过8周的灌胃药物，糖尿病雷米普利组的胰岛素水平虽较糖尿病生理盐水组无显著差异，但较对照组也无明显差异，说明灌胃药物发挥了一定作用。
2.2 大鼠血浆与心肌中AngⅡ含量的变化
与对照组相比，糖尿病生理盐水组血浆、心肌组织中AngⅡ含量均明显升高（P＜0.01），提示大鼠糖尿病时，血浆与心肌组织中Ang Ⅱ生成明显增加，Ang Ⅱ含量明显的升高，推测AngⅡ在糖尿病大鼠心脏损伤中发挥着很重要的作用；与糖尿病生理盐水组相比，糖尿病雷米普利组血浆中、组织中Ang Ⅱ含量明显降低（P＜0.01），见表2。提示，灌胃药物雷米普利明显抑制大鼠心肌中AngII含量，抑制Ang Ⅱ的大鼠模型塑造成功。
2.3 大鼠心功能变化
与对照组相比，糖尿病生理盐水组dp/dtmax显著下降（P＜0.01）、LVSP明显下降（P＜0.05)、LVEDP明显升高（P＜0.01）；提示大鼠糖尿病后，心功能受到影响，心脏能力降低；与糖尿病生理盐水组相比，糖尿病雷米普利组dp/dtmax明显升高（P＜0.01)、LVEDP明显下降（P＜0.01），见表3。提示灌胃药物后，大鼠心功能有明显的改善。
2.4 心肌细胞凋亡指标变化
与对照组相比，糖尿病生理盐水组Caspase-3显著升高（P＜0.01），提示：糖尿病大鼠心肌细胞有明显的凋亡现象发生；与糖尿病生理盐水组相比，糖尿病雷米普利组Caspase-3显著下降（P＜0.01），见表4。提示：糖尿病雷米普利组经治疗后较糖尿病生理盐水组细胞凋亡显著减少，心肌细胞损伤明显减轻。
2.5 大鼠血浆CK-MB 、cTnI变化
与对照组相比，糖尿病生理盐水组CK-MB、 cTnI均显著升高，（P＜0.01）提示2型糖尿病时大鼠心肌明显受到损伤；与糖尿病生理盐水组相比，糖尿病雷米普利组CK-MB、cTnI均明显下降（P＜0.01），见表5。结果提示，经过药物灌胃后糖尿病雷米普利组心肌损伤较糖尿病生理盐水组明显减轻，说明对于Ang Ⅱ的抑制明显减轻了糖尿病时大鼠心肌的损伤。
2.6 大鼠心肌组织SOD、MDA变化
与对照组相比，糖尿病生理盐水组MDA值显著升高（P＜0.01）、SOD值显著下降（P＜0.01），提示糖尿病大鼠心肌细胞脂质过氧化程度加快，细胞清除氧自由基的能力减弱，心肌细胞明显受到损伤；与糖尿病生理盐水组相比，糖尿病雷米普利组MDA值显著下降（P＜0.01）、SOD值显著升高（P ＜0.01），见表6。提示糖尿病雷米普利组经过灌胃治疗，细胞脂质过氧化程度减慢，细胞清除氧自由基的能力加强，心肌细胞的损伤明显减轻，证明通过抑制AngII含量，缓解了大鼠心肌的损伤。
近年来，糖尿病在我国呈现快速上升的趋势，据2007～2008年我国开展的糖尿病大规模流行病学调查结果显示，全国糖尿病的患病率已达9.7%，糖尿病前期的患病率高达15.5%，我国已成为全球糖尿病患者最多的国家；调查研究还显示，2型糖尿病患者发生心血管疾病和猝死的危险比普通人群高出2～4倍，同时寿命减少5～10年，在所有与糖尿病相关的死亡中，80%左右与心血管疾病相关，心血管疾病已成为糖尿病患者最主要的并发症和首要致死原因。
来自HOPE[6]的临床调查报告发现，给予雷米普利每日10mg长期口服治疗的患者与安慰剂对照组相比，糖尿病新发比率降低34%；同时也有研究表明，糖尿病患者血中的Ang Ⅱ水平有明显升高的现象[7]，我们推测血管紧张素II在糖尿病引起的损伤中发挥了很重要的作用。我们在实验中观察到，2型糖尿病大鼠与对照组大鼠相比，血浆与心肌组织中血管紧张素Ⅱ的含量都明显升高，由此推测糖尿病引起了大鼠血管紧张素系统的变化，血管紧张素Ⅱ的升高参与了糖尿病�糖高脂介导的心脏功能损伤，在接下来的实验中便证实了这一点。实验中发现，糖尿病组心功能LVSP、dp/dtmax明显降低，LVEDP明显升高，表明糖尿病时，大鼠心脏功能明显减弱；糖尿病组Caspase-3明显高于对照组，说明糖尿病大鼠心肌细胞凋亡严重，心肌细胞明显受到损伤；糖尿病组血浆中CK-MB 、cTnI含量明显升高，CK-MB、cTnI作为两种心肌损伤标记物，其在糖尿病大鼠血浆中含量的明显升高，表明糖尿病时，大鼠心肌受到了明显的损伤；糖尿病组心肌组织中MDA明显升高、 SOD明显降低；而通过对血管紧张素Ⅱ抑制后发现，糖尿病雷米普利组同糖尿病生理盐水组相比较，心功能有了明显的改善，心肌细胞的凋亡明显地减少，血浆CK-MB、cTnI明显地升高，心肌组织MDA 明显地升高、SOD明显地降低。这些就证实了糖尿病时引起的血管紧张素Ⅱ含量的升高，通过影响心肌组织中自由基生成增多的途径，引起了糖尿病时心肌细胞的损伤，心功能的降低；同时也表明了血管紧张素抑制剂可以使糖尿病患者在血糖基本不变的情况下，减轻心脏的损伤，提高心功能，降低糖尿病引起心血管疾病并发症的几率[8]。
关于糖尿病时血管紧张素Ⅱ升高的机制，目前尚不清楚。有研究提示，糖尿病时高糖可引起肺组织血管紧张素转换酶表达及活性增加[9]，转化生长因子-β表达增加，心肌糜蛋白酶表达增加[10]，二者均可分解血管紧张素Ⅰ使得血管紧张素Ⅱ生成增多。
综上所述，我们在实验中使用2型糖尿病大鼠模型证明，血管紧张素Ⅱ升高参与了糖尿病时�糖高脂所介导的心脏功能受损，该损伤与其引起的心肌组织中自由基生成增多有关，通过对血管紧张素Ⅱ的抑制，明显减轻了糖尿病引起的心脏功能受损，明显减少了心肌细胞凋亡。除自由基的大量生成外，糖尿病时还伴有大量炎性介质肿瘤坏死因子α、白细胞介素1等的生成和损伤，血管紧张素Ⅱ是否参与这条途径，我们将在下一步的实验中进行观察。
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（收稿日期：2011-03-16）
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