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【摘要】 目的 制备复合水凝胶并初步考察其在软骨组织工程中的应用。方法 用高碘酸钠对透明质酸进行改性，与中性的胶原反应，37℃下形成水凝胶。二甲氨基苯甲醛反应测透明质酸含量并用TNBS法测胶原与氧化透明质酸的交联度。软骨细胞包埋于水凝胶中培养并观察其生长状态。结果 氧化透明质酸被有效固定于水凝胶中，胶原的氨基与氧化透明质酸的醛基反应形成西夫碱结构，二者交联度随氧化透明质酸含量的增加而提高。软骨细胞在水凝胶中均匀分布且活性良好，透明质酸的添加对细胞生长有一定促进作用。结论 胶原/氧化透明质酸复合水凝胶仿生支架在软骨组织工程中有很大的应用前景。�
【关键词】
胶原；氧化透明质酸；水凝胶；软骨细胞；软骨组织工程
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The preparation and characterization of collagen�oxygenated hyaluronic acid composite hydrogel scaffold.
YAN Xiao�li, FENG Yu�jie, LU Wei, et al.National Engineering Research Center for Biomaterials of Sichuan University,Chengdu 610064,China.
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【Abstract】 Objective
A biomimetic hydrogel is prepared and investigated preliminarily in the application as cartilage tissue scaffold� Methods Collagen and oxygenated hyaluronic acid (HA) which was prepared by sodium periodate were mixed to form hydrogel under physiological condition� Using the dimethylaminobenzadehyde reaction confirm the HA content and the TNBS method was applied to determine the crosslinking degree of composite hydrogel� Chondrocytes of rabbits were embedded in the hydrogel, cultured in vitro and observed� Results Oxygenated HA was fixed effectively in the hydrogel and had no HA dissolving out of its� Schiff�s base formed between the amino of collagen and the aldehyde of HA and the crosslinking degree increased with the increase of hyaluronic acid proportion� Chondrocytes in the hydrogel maintained good phenotype and uniform distribution� Conclusion Collagen�oxygenated HA hydrogel has potential application in cartilage tissue engineering.�
【Key words】
Collagen; Oxygenated hyaluronic acid; Hydrogel; Chondrocyte; Cartilage tissue engineering
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支架材料是组织工程的重要组成部分，它不仅起到暂时性替代或修复组织的作用，还为种子细胞提供了生长环境，其化学组成和物理结构对促进细胞的增殖、分化、维持细胞的表型等具有重要的影响��［1�4］�。可注射的水凝胶材料能够自我塑形，用于填充形状和尺寸各异的组织缺损，造成的创伤小，能使得细胞均匀分布在支架材料内部呈三维立体生长，提供仿
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生的环境��［5,6］�，其含有大量的水分可支持营养物质和细胞代谢产物的交换。胶原是细胞外基质的主要构成成分，具有良好的生物相容性、生物降解性和弱抗原性，已被广泛应用于组织工程。透明质酸作为天然软骨细胞外基质的一种成分，可特异地与CD44受体结合，促进细胞与材料间的相互作用并调节细胞行为，但这种水溶性多糖易从支架材料中溶出，为使其能被有效固定于支架中并发挥其生物学作用，本研究将透明质酸用高碘酸钠进行一定的氧化改性��［7］�，然后将其与胶原混合发生反应并制成水凝胶，减少了透明质酸的溶出，使其在支架中发挥调节细胞行为的作用，从而在体外构建组织工程软骨。�
1 实验部分�
1�1 氧化透明质酸的制备与表征
透明质酸钠用超纯水溶解，配制成10 mg/ml的均匀溶液，按一定比例加入浓度为20 mM的高碘酸钠溶液，25℃避光条件下搅拌反应5 h，然后将反应液透析(8000~12000)后冷冻干燥。用FTIR对氧化透明质酸的结构进行表征，并用碱消耗法测定其醛基含量。�
1�2 胶原/氧化透明质酸复合水凝胶的制备及表征
用0�003 m的盐酸溶液在冰水浴下配制0�9%(w/v)的胶原溶液，用超纯水配制0�6%(w/v)的氧化透明质酸(氧化度为40%)溶液。在冰水浴中将胶原溶液、5 高糖DMEM培养基和NaOH�NaHCO��3��Hepes缓冲液以7�∶�2�∶�1的比例混合，调节胶原溶液pH至中性，再将氧化透明质酸溶液以一定比例(10�∶�1、20�∶�1、40�∶�1，胶原：氧化透明质酸(w/w))混入其中，缓慢搅拌均匀，然后放入4℃冰箱静置24 h，使胶原与氧化透明质酸之间发生反应，再将上述混合溶液放入37℃恒温箱中15 min即形成性状良好的水凝胶。�
将称重(W��0�)后的水凝胶材料冻干后，重新称重(W��d�)。水凝胶的含水量=(W��0��W��d�)/W��d�×100%。�
利用二甲氨基苯甲醛反应测定透明质酸的含量，确定用PBS在生理条件下浸泡24 h并经超纯水清洗后的复合水凝胶支架中透明质酸的实际含量。透明质酸水解后的氨基己糖溶液可以与对二甲氨基苯甲醛反应生成红色物质，用紫外分光光度计在527nm测其吸光度，以吸光度对透明质酸溶液浓度做直线可得到标准曲线，并由标准曲线计算出支架中透明质酸的含量。�
复合水凝胶的交联度用TNBS法测定。在60℃恒温水浴中，使得复合水凝胶支架中胶原的未反应氨基与三硝基苯磺酸(TNBS)反应形成可溶性物质，再加入6 m HCl消化支架材料使其完全溶解，用紫外分光光度计在345nm波长处测吸光度A。交联度(%)=(1�交联后胶原的吸光度/未交联胶原的吸光度)×100%。�
1�3 生物相容性评价
分离提取4周龄日本大耳白兔的关节软骨细胞并传代培养，传代两次后收集软骨细胞，在胶原/氧化透明质酸材料形成水凝胶前与之相混合(种植密度为5×10��6�个/ml)，待水凝胶形成后实现了软骨细胞在水凝胶支架中的包埋，用DMEM高糖培养基进行培养，在体外构建了软骨细胞生长的类似于机体环境的仿生三维支架用以考察胶原/氧化透明质酸复合水凝胶的生物相容性及在软骨组织工程中应用的潜力。一段时间后，用荧光二乙脂荧光素(Flurescein diacetate，FDA)与碘化丙啶(Propidium iodide，PI)对细胞/水凝胶复合物进行染色，在激光共聚焦显微镜下观察软骨细胞在水凝胶支架材料中的生长状态。�
2 结果�
2�1 透明质酸的氧化与表征
透明质酸分子中两个相邻的羟基被强氧化剂高碘酸钠氧化为醛基，通过控制高碘酸钠和透明质酸的比例可以得到具有不同氧化度的氧化透明质酸。经氧化改性后的透明质酸，其水溶液的粘度有一定的降低。从FTIR可以看出，透明质酸在氧化前后的红外吸收基本保持一致，说明这种程度的氧化反应对透明质酸的整体分子结构没有重大影响，这对于保持透明质酸与细胞之间的相互作用位点，保持其生物活性是很重要的。在1732 cm(V��c=o�)的位置，氧化后的透明质酸出现了一个微弱的新吸收，这是氧化后产生的醛基结构的伸缩振动吸收。由于其位置与透明质酸自身的吸收非常接近，大部分醛基的吸收被透明质酸的吸收所屏蔽，因此这一新出现的吸收表现为一个很微弱的肩峰形式，但是仍然可以在谱图中辨别出来。此外，通过碱消耗法测定，所制备的氧化透明质酸其氧化度为40%，说明透明质酸的双羟基被氧化为醛基，且氧化度由高碘酸钠和透明质酸的比例所控制。�
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2�2 胶原/氧化透明质酸复合水凝胶的制备与表征
氧化透明质酸的水溶液可与调节至中性的胶原溶液均匀混合，在中性条件下，胶原分子的氨基可与透明质酸氧化后得到的醛基发生反应形成Schiff碱结构，实现一定程度的化学交联，且胶原在中性环境中当温度升高至37℃时，纤维发生重排形成水凝胶。水凝胶含水量的测定表明，氧化透明质酸不同添加量的复合水凝胶和纯胶原水凝胶的含水量均在97�0%(±0�1)左右，表明其可以良好的支持细胞培养介质和代谢产物的交换，为细胞提供仿生的生长环境，适合细胞生长增殖。表1为复合水凝胶中的透明质酸含量，从表中可以看出，所测得的经浸泡处理的复合水凝胶支架中透明质酸的实际含量与理论含量基本相符，这表明已经将透明质酸有效地固定到复合水凝胶支架材料中。�
用TNBS法测定复合水凝胶(所添加的透明质酸氧化度为40%，添加比例为10�∶�1、20�∶�1和40�∶�1，胶原/透明质酸，w/w)的主体材料胶原中的氨基含量，可以计算得到胶原与氧化透明质酸的交联度，结果如表2所示。可以从中看出，当透明质酸的氧化度为40%时，随着透明质酸添加量的增大，复合水凝胶中胶原与氧化透明质酸的交联度随之提高，这也能在一定程度上增强胶原水凝胶的力学强度。�
2�3 生物相容性评价
将软骨细胞与水凝胶复合后进行体外培养，图2为软骨细胞/水凝胶复合培养3 d后的照片，如图所示，包埋细胞后的水凝胶保持了良好的性状，复合水凝胶发生了一定的收缩(水凝胶初始直径为15 mm)，表明水凝胶中细胞生长状态良好，这主要是由于细胞的生长对材料有一定的力学作用，最终水凝胶的收缩状态是由支架材料本身的力学强度和支架中细胞的生长状态共同决定的。�
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软骨细胞在水凝胶支架中包埋培养1周后的激光共聚焦显微镜照片，从A1、B1、C1和D1可以看出软骨细胞在水凝胶中的分布状态，A2、B2、C2、D2可以看出软骨细胞在其中的形态。从结果中可以看到，软骨细胞在各水凝胶材料中分布均匀，其表型保持良好，且可以看出添加了透明质酸的各复合水凝胶中的细胞生长状态优于纯胶原水凝胶，细胞有一定的增殖，呈圆形，几乎没有发现死细胞。�
3 讨论�
透明质酸经高碘酸钠氧化改性后，与胶原发生反应，被有效地固定于胶原基复合水凝胶中，避免了透明质酸从支架材料中的溶出，所得到的复合水凝胶材料性状良好、具有良好的细胞相容性。软骨细胞在水凝胶中能够均匀分布，且活性良好，透明质酸的添加对软骨细胞表型的保持有一定的促进作用，此胶原/氧化透明质酸复合水凝胶可望成为一种良好的软骨组织工程支架材料。��
参 考 文 献�
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